在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中，蛋白質(zhì)是通過使用帶有傳感標(biāo)簽（如共軛熒光團(tuán)、同位素標(biāo)簽或量子點(diǎn)）的親和探針進(jìn)行分析的，這些探針會(huì)發(fā)射或轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。為了實(shí)現(xiàn)高靈敏度并促進(jìn)單細(xì)胞水平的靶向蛋白質(zhì)組織學(xué)鑒定，微流體的使用越來越多，主要是因?yàn)樗鼈兲峁┝藰?biāo)記過程中更高的有效濃度、可控的細(xì)胞操作、大大減少的試劑消耗以及提高多路復(fù)用性和吞吐量的設(shè)計(jì)靈活性等優(yōu)點(diǎn)。

基于細(xì)胞計(jì)量學(xué)的單細(xì)胞方法

流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是一種標(biāo)準(zhǔn)的分析技術(shù)，通過量化單個(gè)細(xì)胞的熒光發(fā)射和散射光，每秒可以計(jì)數(shù)和分析數(shù)千個(gè)細(xì)胞。使用FCM和熒光抗體來分析細(xì)胞中的蛋白質(zhì)一直是生物科學(xué)的主流和廣泛應(yīng)用。然而，F(xiàn)CM的細(xì)胞內(nèi)空間信息有限，通常需要數(shù)十到數(shù)百μL的樣本量。當(dāng)將流式細(xì)胞儀縮小到微流體尺寸時(shí)，多參數(shù)測(cè)量的帶寬會(huì)受到損害，例如，在高通量設(shè)置（>2000個(gè)細(xì)胞/秒）下表征細(xì)胞形態(tài)是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。為了解決這個(gè)問題，成像流式細(xì)胞術(shù)（IFC）結(jié)合了高通量FCM和高分辨率成像顯微鏡的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞信息豐富的檢測(cè)（圖3a）。此外，IFC與微流體的集成允許簡(jiǎn)單的光學(xué)實(shí)現(xiàn)和對(duì)細(xì)胞操作的精細(xì)控制。請(qǐng)注意，在大多數(shù)IFC微系統(tǒng)中，流體通量和光學(xué)檢測(cè)之間的權(quán)衡為在高通量下獲得體面的空間分辨率帶來了挑戰(zhàn)。為了解決這個(gè)問題，Holzner等人引入了使用多色熒光和亮場(chǎng)分析的多參數(shù)IFC，該方法能夠高分辨率和高通量地提取細(xì)胞形態(tài)特征，如準(zhǔn)確的細(xì)胞大小和檢測(cè)人類細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)蛋白。該方法將頻閃照明（即一種為高速運(yùn)動(dòng)的物體生成無模糊圖像的技術(shù)）與彈性慣性3D細(xì)胞聚焦相結(jié)合，分別有效地控制流速和細(xì)胞定位，從而實(shí)現(xiàn)每秒104個(gè)細(xì)胞的采集率。

FCM的主要局限性之一源于從熒光標(biāo)記中檢索到的信號(hào)的光譜重疊。為了解決這個(gè)問題，Bandura等人引入了質(zhì)量細(xì)胞術(shù)（飛行時(shí)間細(xì)胞術(shù)（CyTOF）），該技術(shù)協(xié)同F(xiàn)CM和電感耦合質(zhì)譜（ICP-MS），用于同時(shí)免疫檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中約20種表面抗原。原則上，單細(xì)胞分析可以獲得多達(dá)100個(gè)參數(shù)，因?yàn)榧s100種同位素可用于標(biāo)記抗體。使用這種技術(shù)，細(xì)胞被用定制的多原子標(biāo)簽標(biāo)記的抗體進(jìn)行免疫染色，然后提交給ICP-TOF-MS分析?；诒砻鏄?biāo)記，單細(xì)胞CyTOF用于識(shí)別人類造血連續(xù)體中的異質(zhì)性。 Porpiglia等人使用單細(xì)胞CyTOF對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記和肌源性轉(zhuǎn)化因子進(jìn)行并發(fā)分析，從而能夠解決肌源性隔室的異質(zhì)性，并表征骨骼肌細(xì)胞中從干細(xì)胞到祖細(xì)胞的肌源性進(jìn)展。為了解決DNA條形碼的表型和分辨率有限的問題，Wroblewska等人開發(fā)了一種條形碼系統(tǒng)，該系統(tǒng)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域運(yùn)行,促進(jìn)了高維單細(xì)胞CRISPR篩查。通過這種方法，通過合成模塊和編碼線性表位的三重組合，生成了100多種蛋白質(zhì)條形碼（Pro代碼）。隨后對(duì)Pro編碼轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)載體進(jìn)行CyTOF分析，僅使用14種抗體即可檢測(cè)364個(gè)Pro編碼群體。CyTOF也用于鑒定臨床上重要的免疫重建。最近，Stern等人研究了人巨細(xì)胞病毒再激活不同階段免疫重建的演變變化，這是異基因造血干細(xì)胞移植后的主要并發(fā)癥。在這項(xiàng)研究中，CyTOF最大化了從有限樣本量（就細(xì)胞數(shù)量和血容量而言）中提取的數(shù)據(jù)容量。一般來說，CyTOF比FCM更有利于多路分析。由于檢測(cè)通道之間沒有重疊，由于對(duì)樣品基質(zhì)的獨(dú)立元素反應(yīng)，可以進(jìn)行絕對(duì)定量。

同時(shí)，FCM和CyTOF在處理單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行熒光時(shí)會(huì)丟失關(guān)鍵的空間信息。為了解決這個(gè)問題，通過將質(zhì)譜儀擴(kuò)展到成像質(zhì)譜儀（IMC），設(shè)計(jì)了組織樣本的單細(xì)胞分析，包括（但不限于）冷凍組織切片和福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織。 IMC應(yīng)用激光消融用同位素標(biāo)記抗體染色的組織或組織切片，用脈沖激光掃描和汽化，并在質(zhì)譜儀分析之前轉(zhuǎn)移到ICP-MS檢測(cè)。Jackson等人最近利用一個(gè)由35種生物標(biāo)志物組成的IMC小組來量化癌癥組織的臨床樣本。通過381張圖像中約8.55×105個(gè)細(xì)胞的標(biāo)記基因表達(dá)和單個(gè)細(xì)胞的空間特征，確定了腫瘤單細(xì)胞表型。單細(xì)胞IMC提供了空間分辨分析，這可能有助于研究表型異質(zhì)性及其在腫瘤結(jié)構(gòu)中的作用。目前，IMC面板的多路復(fù)用能力達(dá)到40個(gè)生物標(biāo)記。為了挖掘2D IMC中無法檢測(cè)到的信息，Kuett等人將空間分辨率擴(kuò)展到3D，以便在TME中研究腫瘤侵襲。 Gerdtsson等人還證明了IMC與高清晰度單細(xì)胞分析（HD-SCA）檢測(cè)的整合，該檢測(cè)使用免疫熒光來表征沉積在載玻片上的數(shù)百萬白細(xì)胞中的罕見腫瘤細(xì)胞。通過使用IMC，對(duì)HD-SCA鑒定的CTC內(nèi)標(biāo)記的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了液體活檢的深入表型分析。

微蝕刻法

微重力法利用亞納升孔捕獲細(xì)胞，細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)被預(yù)處理的載玻片捕獲，載玻片上涂有親和探針（抗體或抗原）。Love等人開創(chuàng)了微重力生物芯片，其中微孔是通過沉積細(xì)胞懸浮液制備的，使細(xì)胞在去除多余的未被追蹤的細(xì)胞之前沉淀下來（圖3b）。然后將刻有抗體或抗原的載玻片貼在封閉的單細(xì)胞上，并通過熒光免疫測(cè)定法檢測(cè)分泌的蛋白質(zhì)。Schubert等人開發(fā)了一種單分子陣列（SiMoA）平臺(tái)，該平臺(tái)能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)胞中的少量蛋白質(zhì)進(jìn)行計(jì)數(shù)。SiMoA表明，前列腺特異性抗原的表達(dá)在前列腺癌癥細(xì)胞中不同，并隨著基因漂移而變化。Jia等人探索了微雕刻方法來研究非人靈長類動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗的縱向回憶反應(yīng)。自首次亮相以來，不斷努力提高微雕刻方法的靈敏度，推動(dòng)了從單細(xì)胞中檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)。Li等人介紹了一種在蛋白質(zhì)檢測(cè)中使用微孔平臺(tái)的信號(hào)放大方法，其中光學(xué)的軸向分辨率（即深度場(chǎng)）得到了提高，側(cè)壁和邊緣捕獲的熒光標(biāo)簽也對(duì)信號(hào)做出了貢獻(xiàn)。與僅從平面發(fā)出熒光的傳統(tǒng)微重力方法相比，值得注意的是，邊緣增強(qiáng)微孔免疫測(cè)定將靈敏度提高了6倍。增強(qiáng)熒光的另一種方法是用半導(dǎo)體量子點(diǎn)代替有機(jī)染料，半導(dǎo)體量子點(diǎn)可用作熒光報(bào)告器來檢測(cè)單細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)。總之，基于微孔的檢測(cè)比傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)（ELISpot）檢測(cè)具有更高的靈敏度。此外，這種方法還具有適用于下游分析的細(xì)胞分離等優(yōu)點(diǎn)，并能夠通過多抗體雕刻的載玻片對(duì)單細(xì)胞分泌體進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究。

基于條形碼的方法

希思小組開發(fā)的單細(xì)胞條形碼芯片（SCBC）是分析單細(xì)胞蛋白質(zhì)的首批基于條形碼的方法之一。在該系統(tǒng)中，單細(xì)胞通過微流體處理，并在觸發(fā)細(xì)胞分泌或裂解的微室中分離，目標(biāo)分析物被“條形碼陣列”捕獲并熒光檢測(cè)，其中各種DNA編碼的抗體被涂覆在玻璃基板的預(yù)定區(qū)域上（圖3c）。使用SCBC，從巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞收集的10多種分泌蛋白的功能異質(zhì)性通過微環(huán)境激活進(jìn)行表征。自SCBC引入以來，人們一直在努力提高其檢測(cè)性能，并擴(kuò)展其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的應(yīng)用。例如，SCBC的應(yīng)用通過獲得藥物狀態(tài)和藥物耐受狀態(tài)之間軌跡的時(shí)間分辨特征，揭示了藥物耐受的機(jī)制。Kravchenko-Balasha等人利用SCBC分析分離的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腦癌癥細(xì)胞的分泌蛋白。后來，多組學(xué)工作流程與SCBC整合：Xu等人測(cè)量轉(zhuǎn)錄物和裂解蛋白和Su等人通過與所選癌癥標(biāo)志物相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)蛋白和代謝產(chǎn)物研究了細(xì)胞異質(zhì)性，這些標(biāo)志物在早期藥物反應(yīng)過程中功能發(fā)生了變化。最近，Wang等人介紹了一種使用氧化石墨烯量子點(diǎn)（GOQD）的單細(xì)胞多指數(shù)分泌生物標(biāo)志物分析方法；結(jié)果表明，GOQD組裝的底物導(dǎo)致抗體固定密度提高了2倍（與聚賴氨酸底物相比），背景噪聲降低了。多年來，SCBC已經(jīng)配備了不斷發(fā)展的微系統(tǒng)，導(dǎo)致多路復(fù)用性增加（>42種蛋白質(zhì)），吞吐量提高（>1000個(gè)細(xì)胞），熒光分辨率更高。

趙等人還介紹了另一種基于多重原位標(biāo)記（MIST）的條形碼功能SCP策略，其中可以分析單細(xì)胞中的數(shù)十至數(shù)百個(gè)分子靶點(diǎn)。為此，在載玻片上對(duì)單層ssDNA-編碼微珠進(jìn)行圖案化，與互補(bǔ)的DNA-抗體偶聯(lián)物雜交，然后用含有單細(xì)胞的PDMS微孔封閉。通過熒光夾心ELISA，然后分析每種珠子，以檢測(cè)數(shù)千個(gè)陣列中的特定蛋白質(zhì)。這種方法的后續(xù)發(fā)展導(dǎo)致了單細(xì)胞循環(huán)多重原位標(biāo)記（CycMIST）平臺(tái)的出現(xiàn)，在該平臺(tái)中，使用紫外線可切割的DNA條形碼抗體來實(shí)現(xiàn)多輪標(biāo)記和多循環(huán)解碼過程，以實(shí)現(xiàn)高通量和靈敏度。高密度DNA陣列和小尺寸微孔的聯(lián)合作用允許從單個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到約180個(gè)蛋白質(zhì)拷貝。

微流控毛細(xì)管電泳和單細(xì)胞蛋白質(zhì)印跡

毛細(xì)管電泳（CE）是一種分析方法，其特點(diǎn)是使用高電場(chǎng)進(jìn)行高分離效率和靈敏的離子檢測(cè)。傳統(tǒng)的CE存在分離時(shí)間長、樣品消耗大和焦耳熱耗散慢的問題。另一方面，微流體CE（MCE）能夠解決這些局限性。MCE使用微通道在納升尺度上對(duì)生物分子進(jìn)行電泳分離，分析時(shí)間需要數(shù)十秒，可用于分離和檢測(cè)從單細(xì)胞中提取的細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物。Huang等人開發(fā)了一種MCE，通過使用單分子熒光測(cè)量來檢測(cè)單細(xì)胞中的低拷貝數(shù)（LCN）蛋白質(zhì)。請(qǐng)注意，這種方法的吞吐量相對(duì)較低，多路復(fù)用能力有限。為了提高通量，Mainz等人利用光可編程和細(xì)胞可滲透的報(bào)告器同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的激酶活性。Li等人還提出了一種基于多色熒光檢測(cè)的微流體裝置，用于單細(xì)胞操作，該裝置提供了有效的電泳分離，以實(shí)現(xiàn)多個(gè)小分子的同時(shí)檢測(cè)。總體而言，MCE利用短距離和相對(duì)較短的時(shí)間尺度，可以快速完成傳統(tǒng)CE中采取的所有步驟。

微流體中使用的另一種電泳方法是A.Herr小組開發(fā)的單細(xì)胞蛋白質(zhì)印跡（scWB），其中特定蛋白質(zhì)的鑒定和定量取決于它們通過與抗體探針結(jié)合的薄層凝膠基質(zhì)的遷移（圖3d）。 scWB將蛋白質(zhì)印跡與開放式微孔陣列相結(jié)合，從而提高了檢測(cè)通量，并能夠可靠地處理約2000個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞。請(qǐng)注意，scWB的早期發(fā)展主要集中在處理大量輸入細(xì)胞，例如>1000個(gè)輸入細(xì)胞，因此無法處理質(zhì)量有限的輸入細(xì)胞。為了解決這個(gè)問題，Sinkala等人將稀有細(xì)胞工作流程與scWB相結(jié)合，以分析單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）的蛋白質(zhì)表達(dá)（復(fù)雜性=8）。具體來說，從患者血液中收集的細(xì)胞根據(jù)大小和變形性進(jìn)行選擇，對(duì)大有核細(xì)胞進(jìn)行染色和鑒定，然后轉(zhuǎn)移到微孔中。然后裂解這些細(xì)胞，將相關(guān)蛋白電泳注射到凝膠中，依次進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、印跡和免疫印跡步驟。最近，差異分級(jí)被整合到電泳分離中：特別是，J.Vlassakis等人通過電泳和免疫測(cè)定讀數(shù)（SIFTER）引入了單細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用分級(jí)，用于定量單細(xì)胞中的多聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物。在這項(xiàng)工作中，進(jìn)行了雙向電泳，單體和解聚的蛋白質(zhì)復(fù)合物被分級(jí)并固定在微孔周圍的凝膠區(qū)域，然后使用凝膠內(nèi)免疫探針進(jìn)行定量。除了高通量和負(fù)擔(dān)得起的多重性的優(yōu)點(diǎn)外，scWB還由于電泳分離而提高了抗體的特異性。

液滴微流體

液滴微流體技術(shù)能夠通過在納升體積的液滴中用熒光探針進(jìn)行液滴包封來定量單個(gè)細(xì)胞釋放的分泌體，克服了微流體FCM無法檢測(cè)分泌蛋白的技術(shù)限制。液滴微流控技術(shù)也被用于分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，其中一到三個(gè)細(xì)胞在液滴形成之前被電裂解。丁等人最近使用共流液滴微流技術(shù)將原代細(xì)胞（取自組織）與捕獲微珠和熒光標(biāo)記抗原一起包封（圖3e）。在液滴培養(yǎng)過程中，所需的細(xì)胞（如B細(xì)胞）分泌第一抗體，以介導(dǎo)熒光團(tuán)標(biāo)記的抗原與微珠之間的結(jié)合。隨后，通過熒光信號(hào)對(duì)被熒光抗原“標(biāo)記”的所需液滴進(jìn)行分選（圖3e）。液滴微流控方法可實(shí)現(xiàn)高通量分析；然而，檢測(cè)珠（在焦平面上）的排列使得對(duì)分泌的抗體進(jìn)行定量變得具有挑戰(zhàn)性。為了解決這個(gè)問題，通過在液滴產(chǎn)生后將熱固性油的包封轉(zhuǎn)化為固體來證明液滴的固定化。另一方面，Eyer等人引入了一種基于液滴的微流體技術(shù)（DropMAP），從固定在2D陣列上的液滴中引出單細(xì)胞分析。DropMAP能夠?qū)崟r(shí)測(cè)量以量化抗體分泌率、免疫親和性和相關(guān)動(dòng)力學(xué)。關(guān)于DropMAP的工作原理，包封了兩個(gè)水相，其中一個(gè)包含細(xì)胞或校準(zhǔn)抗體，另一個(gè)包含試劑（熒光標(biāo)記和300 nm順磁性納米顆粒）。由于使用了納米顆粒，抗體的結(jié)合能力得到了提高。當(dāng)施加磁場(chǎng)時(shí)，納米粒子（旨在捕獲分泌的免疫球蛋白）交聯(lián)，形成微米大小的聚集體。為了促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞在液滴內(nèi)的封裝并提高多路復(fù)用性，Khajvand等人將液滴微流體與抗體條形碼集成在一起。使用約180 pL大小的腔室陣列來提高單細(xì)胞捕獲效率（超過80%，存活率>90%），這種方法大大提高了固定液滴中單細(xì)胞的片上捕獲、分離和長期培養(yǎng)。一般來說，基于液滴的微流體具有快速包封、提高靶濃度、減少樣品之間的交叉污染以及橋接基因型和表型的能力。

總之，迄今為止討論的微流體耦合靶向SCP方法清楚地展示了它們?cè)谕苿?dòng)基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究的關(guān)鍵生物學(xué)理解方面的潛力。盡管基于靶向的SCP方法由于需要親和標(biāo)記而具有內(nèi)在局限性，但微流體和超靈敏生物傳感方法的協(xié)同協(xié)調(diào)可能會(huì)補(bǔ)充基于MS的全局SCP不足的LCN蛋白質(zhì)組領(lǐng)域。由于不存在一刀切的儀器，因此應(yīng)從靶向和全局SCP交替檢索的綜合圖譜應(yīng)結(jié)合在一起，以說明基因組和相關(guān)蛋白質(zhì)組之間的未知變異。

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