單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)（SCP）通過分析單個(gè)細(xì)胞、其生物學(xué)狀態(tài)和信號激活后的功能結(jié)果來揭示表型異質(zhì)性，而這些特征很難通過其他組學(xué)特征來探測。這對研究人員來說很有吸引力，因?yàn)樗軌蚋娴亓私饧?xì)胞過程、疾病發(fā)生和進(jìn)展背后的生物學(xué)細(xì)節(jié)，并促進(jìn)從單個(gè)細(xì)胞中識別獨(dú)特的生物標(biāo)志物?；谖⒘黧w的策略已成為單細(xì)胞分析的首選方法，因?yàn)樗鼈冊试S簡單的檢測集成，如細(xì)胞分選、操作和含量分析。值得注意的是，它們一直是一種使能技術(shù)，可以提高最近開發(fā)的SCP方法的靈敏度、魯棒性和可重復(fù)性。微流體技術(shù)的關(guān)鍵作用預(yù)計(jì)將在推進(jìn)SCP分析的下一階段進(jìn)一步迅速擴(kuò)大，以揭示更多的生物學(xué)和臨床見解。在這篇綜述中，我們將捕捉到微流體方法在靶向和全局SCP方面的最新成就，包括提高蛋白質(zhì)組覆蓋率、最大限度地減少樣本損失、提高多路復(fù)用性和吞吐量的努力。此外，我們將討論SCP的優(yōu)勢、挑戰(zhàn)、應(yīng)用和未來前景。

復(fù)雜的生物系統(tǒng)受到單個(gè)細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞類型及其生物狀態(tài)，以及它們與細(xì)胞微環(huán)境的相互作用。在許多情況下，群體的常規(guī)集合測量不能代表單個(gè)細(xì)胞的確切狀態(tài)，因?yàn)樗骄瞬煌?xì)胞之間的差異。這種異質(zhì)性對正常和病理樣本的影響促使在基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平上進(jìn)行單細(xì)胞分析。基于組學(xué)的分子圖譜在單細(xì)胞水平上的出現(xiàn)是最近生物學(xué)研究中最重要的突破之一。在過去的二十年里，基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的技術(shù)進(jìn)步逐步推進(jìn)，由于遺傳擴(kuò)增的可行性，能夠從單個(gè)細(xì)胞中表征整個(gè)基因組和轉(zhuǎn)錄組。雖然最近的報(bào)告表明蛋白質(zhì)組圖譜與mRNA表達(dá)相關(guān)性較差，但由于缺乏擴(kuò)增策略和蛋白質(zhì)組的廣泛動(dòng)態(tài)范圍，分析單個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組一直具有挑戰(zhàn)性。為了闡明翻譯過程中缺失的推理，有必要對蛋白質(zhì)進(jìn)行全面表征，以補(bǔ)充單細(xì)胞水平的遺傳測量。

單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)（SCP）是一個(gè)快速發(fā)展的研究領(lǐng)域，其在研究生物系統(tǒng)中的應(yīng)用揭示了關(guān)于同基因細(xì)胞間表型和同一細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞過程的大量關(guān)鍵見解。 SCP分析主要作為靶向和非靶向（全局）方法開發(fā)?；跇?biāo)記的親和探針（如抗體），采用靶向方法檢測分泌和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。另一方面，質(zhì)譜（MS）是全球蛋白質(zhì)組學(xué)分析的主要儀器，已被廣泛用于從大樣本中提取接近完整的蛋白質(zhì)組。然而，在使用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)制備工作流程時(shí)，MS的可行性和靈敏度在單細(xì)胞水平上受到了嚴(yán)重?fù)p害。

為了解決這些局限性，人們付出了巨大的努力來實(shí)現(xiàn)樣品制備的小型化、分析工作流程的優(yōu)化和儀器的集成，旨在實(shí)現(xiàn)更簡化的SCP協(xié)議，同時(shí)將樣品損失降至最低。特別是微流體，非常適合并應(yīng)用于此類工作。它是一個(gè)多學(xué)科平臺，用于將納米到毫微微升的流體樣品精確處理、觀察和加工到所需的微工程隔室中。此外，基于微流體的方法具有成本效益分析、樣品和試劑消耗低、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)增加和接觸面積減少的內(nèi)在特性，從而產(chǎn)生更靈敏的檢測結(jié)果。在過去的十年中，微流體系統(tǒng)作為多任務(wù)平臺蓬勃發(fā)展，通過多功能集成、多路復(fù)用能力和最大化吞吐量，可以促進(jìn)單細(xì)胞研究（圖1）。使用微流體系統(tǒng)的整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程可以在幾納升的體積內(nèi)進(jìn)行（例如一鍋協(xié)議），大大減少了樣品損失。然而，盡管如此，由于整體系統(tǒng)集成、所需的蛋白質(zhì)組覆蓋率和所需的靈敏度，使用MS和微流體的SCP研究仍然具有挑戰(zhàn)性，例如檢測從高豐度到低拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)。由于異質(zhì)單個(gè)細(xì)胞表達(dá)由內(nèi)在和外在因素引發(fā)的獨(dú)特蛋白質(zhì)組，它們在臨床醫(yī)學(xué)進(jìn)步和更廣泛的細(xì)胞生物學(xué)探索中的作用必須由SCP技術(shù)來解決。很少有評論討論基于微流體策略的SCP發(fā)展，但他們的大部分重點(diǎn)要么是多組學(xué)方法（很少強(qiáng)調(diào)基于MS的SCP），要么是微流體技術(shù)的基礎(chǔ)。在這篇綜述中，微流體的最新發(fā)展。將系統(tǒng)地討論基于SCP的SCP，包括其獨(dú)特的特征、優(yōu)勢、局限性、應(yīng)用和未來前景。我們將介紹微流體和單細(xì)胞蛋白質(zhì)靶向分析的能力，然后詳細(xì)描述基于MS的全球SCP分析的最新微流體方法，特別關(guān)注樣品制備的小型化、增強(qiáng)的蛋白質(zhì)組深度以及這些方法所揭示的生物信息。

2.用于生物分子分析的微流體技術(shù)發(fā)展到單細(xì)胞水平

從歷史上看，微流體器件的誕生與微電子和半導(dǎo)體器件制造的開始相關(guān)。自從第一個(gè)芯片實(shí)驗(yàn)室器件被證明是一個(gè)小型化的色譜系統(tǒng)以來，已經(jīng)開發(fā)了種不同的微流體系統(tǒng)，如全化學(xué)分析系統(tǒng)（TAS）、液滴微流體、數(shù)字微流體和許多其他系統(tǒng)，以滿足各自的研究需求。在值得注意的發(fā)展中，G.Whitesides等人引入了軟光刻微圖案技術(shù)，該技術(shù)允許使用彈性體材料聚二甲基硅氧烷（PDMS）使用復(fù)制模制造圖案轉(zhuǎn)移元件。隨后，S.Quake等人應(yīng)用軟光刻技術(shù)制造多層通過嵌入式閥門和蠕動(dòng)泵實(shí)現(xiàn)定制流體控制的微流體。從那時(shí)起，微流體系統(tǒng)在生物工程、生物醫(yī)學(xué)科學(xué)，為了進(jìn)一步將生物分子敏感性降低到單細(xì)胞水平，減少試劑消耗和有效收集細(xì)胞內(nèi)容物起著關(guān)鍵作用。在以下部分中，討論了細(xì)胞處理的一些選定工作，包括細(xì)胞分離、操作、裂解以及與下游儀器的微流體接口。

2.1用于細(xì)胞處理的微流體裝置

單細(xì)胞方法要求在后續(xù)樣品處理之前分離單個(gè)細(xì)胞。因此，細(xì)胞處理技術(shù)已被納入各種微流體平臺進(jìn)行生物研究。下面簡要討論了典型的單細(xì)胞方法，包括液滴、微柱、微孔和集成閥阱。在液滴微流體中，通過在不混溶的載液中分割形成液滴的水流，將單個(gè)細(xì)胞與其他試劑一起包裹起來（圖2a（i））。通過調(diào)節(jié)不混溶流體的不同流速來控制液滴大小，從而在幾秒鐘內(nèi)產(chǎn)生數(shù)千個(gè)液滴。微柱陣列利用形態(tài)陷阱來限制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，從而在細(xì)胞懸浮液流過時(shí)捕獲它們。細(xì)胞捕獲通常需要幾十秒，微柱可以進(jìn)行化學(xué)功能化以提高效率和選擇性（圖2a（ii））。個(gè)細(xì)胞捕獲微孔通過將孔模制成與靶細(xì)胞大小相當(dāng)?shù)某叽鐏砝贸叽缫蕾嚨牟东@。開放式井制造的便利性提供了可調(diào)節(jié)的可擴(kuò)展性和功能性，這對于高通量工作流程來說是理想的（圖2a（iii））。另一種方法利用壓力控制閥，結(jié)合微通道電路來捕獲細(xì)胞。這種方法允許在同一芯片上集成一系列操作，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和并行化（圖2b（iv））。除了上述方法外，還應(yīng)用了額外的功能，如聲學(xué)（圖2b（i））、個(gè)光鑷（圖2b（ii））、個(gè)磁學(xué)（圖2b，iii）、和介電電泳（圖2b，iv），以促進(jìn)細(xì)胞處理和按需分選。這些細(xì)胞分選技術(shù)利用外部力場來偏轉(zhuǎn)靶細(xì)胞在通過微通道時(shí)的流動(dòng)路徑。由于芯片設(shè)計(jì)的靈活性，基于微流體的單細(xì)胞方法易于集成到下游的細(xì)胞操作和分析中，這是大多數(shù)現(xiàn)成的細(xì)胞分選儀器無法提供的功能。

2.2細(xì)胞裂解微型裝置

為了最大限度地提高分析靈敏度，能夠有效提取細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物的細(xì)胞裂解方法非常重要。因此，多種微流體已被證明可用于片上細(xì)胞裂解。Chen等人制作了一種三層結(jié)構(gòu)（PMMA硅片PDMS），用于預(yù)處理大鼠全血，并通過基于洗滌劑的裂解在50分鐘內(nèi)從白細(xì)胞中提取PCR可擴(kuò)增DNA。Irimia等人協(xié)調(diào)了帶有閥門的熱氣動(dòng)執(zhí)行器，在微室中混合單細(xì)胞懸浮液和微裂解洗滌劑（25 pL），通過沿液氣界面的虛擬壁抽出空氣來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞裂解。Sasuga等人提出了另一種在pL級微孔上進(jìn)行的化學(xué)裂解。這種方法遵循典型的基于微孔的細(xì)胞操作，其中裂解試劑通過流動(dòng)池（在PDMS板和由雙面膠帶粘合的玻璃蓋玻片之間），以允許單細(xì)胞測量細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。同時(shí)，為了避免樣品清理步驟，使用微流體裝置開發(fā)了無洗滌劑的裂解方法，如通過機(jī)械（圖2c（i））、激光（圖2c 為了實(shí)現(xiàn)熱解，在硅基底上沉積了一個(gè)溫度傳感器和一個(gè)微型鉑加熱器。此外，還配備了無線感應(yīng)加熱器來加熱大面積的表面，一次可以處理大量的樣品（圖2c（iii）））請注意，上述微流體促進(jìn)的細(xì)胞裂解方法不一定用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，盡管如此，它們可能會(huì)改善SCP分析。總的來說，微流體使用不同的模式提供了受控的裂解能力，這些模式可以根據(jù)單細(xì)胞測定進(jìn)行調(diào)整。更重要的是，該功能可以很容易地與微流體中的現(xiàn)有功能模塊集成，以構(gòu)建簡化的工作流程，避免樣品損失（由于樣品轉(zhuǎn)移），從而提高靈敏度。

2.3微流體與下游檢測技術(shù)的集成

成功地將微流體與分析技術(shù)相結(jié)合，如基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）和液相色譜質(zhì)譜（LC-MS），提高了蛋白質(zhì)組學(xué)分析對質(zhì)量有限樣品的靈敏度。在本節(jié)中，我們重點(diǎn)介紹了微流體與LC-MS的集成。潘等人開發(fā)了一種單探針，這是一種直接與質(zhì)譜儀耦合的小型化接口設(shè)備。這種方法省去了標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜樣品制備，并與質(zhì)譜入口兼容，允許實(shí)時(shí)單細(xì)胞質(zhì)譜分析。此外，為了應(yīng)對電離性較差的樣品的挑戰(zhàn)，Huang等人引入了配備三合一設(shè)置（即取樣、溶劑注入和ESI）的雙探針微芯片（圖2d（i））。在大多數(shù)基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，通常需要超高壓樣品分離，以提高質(zhì)譜讀數(shù)的分辨率并縮短分析時(shí)間；然而，這一特征通常會(huì)導(dǎo)致微流控芯片故障和連接器泄漏。為了解決這個(gè)問題，Eeltink的團(tuán)隊(duì)最近開發(fā)了一種微流體調(diào)制器芯片，用于與高壓LC操作（高達(dá)65 MPa）對接。同樣，Chen等人還提出了一種耐高壓的3D打印多層微流體芯片，可以在LC-MS系統(tǒng)中在4 MPa的背壓下運(yùn)行。接口芯片有兩個(gè)入口，一個(gè)連接到LC，另一個(gè)用于顆粒填充，一個(gè)出口連接到質(zhì)譜儀（圖2d（ii））?？偟膩碚f，將功能模塊集成到微流體中并將其直接與LC-MS系統(tǒng)耦合的努力在簡化工作流程方面具有誘人的前景，可以顯著減少樣品損失并提高分析靈敏度。為單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)開發(fā)的方法在所需的靈敏度和更深入的蛋白質(zhì)組學(xué)覆蓋方面還處于早期階段。

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