3.結(jié)果和討論

3.1.PMP和玻璃細(xì)胞形態(tài)和增殖的比較

圖5比較了標(biāo)準(zhǔn)玻璃蓋玻片和拋光PMP膜上的細(xì)胞培養(yǎng)，兩者在細(xì)胞接種前都涂有聚-L-賴氨酸。第一天的圖像顯示，粘附在兩個(gè)表面上的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞粘附開始的時(shí)間點(diǎn)相似。通過融合發(fā)展判斷的細(xì)胞增殖率也是可比的，兩種材料上的細(xì)胞形態(tài)也是如此。48小時(shí)后的鈣黃綠素AM染色證實(shí)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，細(xì)胞以相似的數(shù)量存活。

由于聚苯乙烯制成的細(xì)胞培養(yǎng)板和玻璃蓋玻片是用于細(xì)胞培養(yǎng)和成像的最常見材料，因此對可能的新材料進(jìn)行基準(zhǔn)測試非常重要。對于聚苯乙烯孔板和通常的玻璃蓋玻片，PMP也必須進(jìn)行表面處理以促進(jìn)細(xì)胞粘附。在初步研究中，我們比較了未經(jīng)治療的PMP、經(jīng)血漿治療的PMP，經(jīng)聚-L-賴氨酸治療的PMP和經(jīng)血漿加聚-L-溶血素治療的PMP。在未經(jīng)處理的PMP上，細(xì)胞幾乎不粘附，細(xì)胞形態(tài)圓潤收縮。Slepi?ka等人和Michaljani?ová等人也分別對血管平滑肌細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH 3T3）進(jìn)行了觀察。在三種治療中的任何一種的PMP上，細(xì)胞粘附、增殖和形態(tài)與圖5相似。

等離子體處理通常用于增加聚合物的親水性，從而增加細(xì)胞粘附和增殖。它也是制造用于貼壁細(xì)胞的商業(yè)聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板的最常見方法。Slepi?ka等人和Michaljani?ová等人研究了PMP等離子體處理的變體，以提高該材料在組織工程中的細(xì)胞相容性。Slepi?ka等人使用低功率（3和8 W）的Ar等離子體，而Michaljanii?ová等人使用高功率的氬或O2/Ar等離子體。其他參數(shù)也有所不同。對于所有血漿處理的變體，他們表明，與接觸角約為100°的未處理PMP相比，水接觸角顯著降低，細(xì)胞在血漿處理的PMP上成功粘附和增殖，而非未處理的PMP。然而，他們還表明，在等離子體處理后，接觸角在接下來的幾天內(nèi)再次逐漸向未處理值增加。對于Slepi?ka等人進(jìn)行的低功率等離子體處理，恢復(fù)到更高接觸角的速度比Michaljani?ová等人進(jìn)行的更高功率等離子體處理快，其中一些樣品保持在60°接觸角至少9天。除水接觸角之外的其他因素也可能影響細(xì)胞粘附，需要更多的研究來了解所有實(shí)驗(yàn)參數(shù)隨時(shí)間的相互作用。對于將PMP用于OoC和長期片上細(xì)胞培養(yǎng)，血漿處理產(chǎn)生處理后多年穩(wěn)定的PMP表面，就像今天商業(yè)TCPS板的情況一樣，將是非常有益的。這將簡化芯片實(shí)驗(yàn)室社區(qū)工程師和生物學(xué)家之間的合作，使實(shí)驗(yàn)更加實(shí)用，并允許大規(guī)模生產(chǎn)即用型設(shè)備。

在這項(xiàng)工作中，由于與實(shí)驗(yàn)工作流程的更好兼容性，聚-L-賴氨酸處理被選為提高PMP細(xì)胞相容性的方法。

3.2.透射光和熒光共聚焦顯微鏡的適用性

在用于長期細(xì)胞培養(yǎng)和OoC應(yīng)用的微流體設(shè)備中，能夠用顯微鏡連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞狀態(tài)至關(guān)重要。由于熒光染色和成像可能因光毒性而隨著時(shí)間的推移對細(xì)胞有害，并且只能使部分細(xì)胞可見，因此透射光顯微鏡是首選的細(xì)胞監(jiān)測方法。圖5表明，在玻璃和PMP上成像時(shí)，細(xì)胞的外觀相似，因此PMP的光學(xué)特性適用于該應(yīng)用。

商用PMP薄膜被擠出，一面有光澤，一面無光澤。據(jù)我們所知，目前市場上還沒有完全透明的PMP薄膜。盡管熒光成像在這些商業(yè)膠片上是可行的，但粗糙度較高的亞光面會干擾透射光成像，從而無法進(jìn)行可靠的細(xì)胞觀察。這在補(bǔ)充圖S3中得到了證明。為了獲得適用于顯微鏡的PMP薄膜，應(yīng)用了亞光側(cè)的拋光方法。拋光過程可以進(jìn)一步優(yōu)化，以防止由于施加的機(jī)械力而偶爾劃傷和彎曲PMP膜。

本文首次報(bào)道了在PMP上生長的活細(xì)胞的透射光圖像。Slepi?ka等人和Michaljani?ová等人展示了在血漿處理的PMP上生長的細(xì)胞的熒光圖像，這些細(xì)胞被固定并熒光標(biāo)記，但沒有伴隨的透射光圖像。Nishikawa等人和Danoy等人分別在I-P型膠原蛋白包被的PMP上培養(yǎng)原代大鼠肝細(xì)胞和冷凍保存的原代人肝細(xì)胞，以更準(zhǔn)確地評估肝細(xì)胞代謝和藥物篩選。然而，透射光顯微鏡圖像沒有如本文所示。我們不知道其他在PMP上培養(yǎng)細(xì)胞的工作。如上所述，在微流體裝置中細(xì)胞培養(yǎng)過程中用于細(xì)胞監(jiān)測的透射光顯微鏡至關(guān)重要，因此，我們認(rèn)為這里提出的結(jié)果是闡明PMP適用于片上器官和長期細(xì)胞培養(yǎng)裝置的重要一步。

為了詳細(xì)研究細(xì)胞機(jī)制和反應(yīng)，共聚焦顯微鏡等高分辨率成像技術(shù)是必要的。在PDMS中制造的常見微流體細(xì)胞培養(yǎng)裝置的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是，由于材料的高彈性，需要毫米范圍內(nèi)的裝置厚度來獲得足夠的剛性，以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健的通道幾何形狀。為了進(jìn)行高分辨率成像，通常需要小于0.3毫米的工作距離，因此毫米厚的PDMS設(shè)備是不切實(shí)際的。當(dāng)試樣與蓋玻片直接接觸時(shí)，大多數(shù)物鏡都設(shè)計(jì)為與厚度為0.17 mm的玻璃蓋玻片（蓋玻片#1.5）一起工作。在我們的工作中，我們使用了厚度最接近此厚度且薄至0.125 mm的市售PMP薄膜。由于PMP是一種熱塑性材料，即使在這種厚度下，其剛度也適合構(gòu)成堅(jiān)固、平坦的通道壁，從而允許共聚焦顯微鏡，如圖5所示。根據(jù)制造商Mitsui Chemicals，股份有限公司的說法，PMP像玻璃一樣透明，對可見光具有優(yōu)異的透過率（>93%；霧度<5%）。此外，PMP在紫外線范圍內(nèi)顯示出比玻璃更好的透射率?？傊?，PMP似乎非常適合細(xì)胞成像，以及更專業(yè)的高分辨率成像技術(shù)，如共聚焦顯微鏡。

3.3.與細(xì)胞培養(yǎng)和顯微鏡樣品制備常用化學(xué)品的兼容性

用于細(xì)胞培養(yǎng)的微流體裝置中的材料的另一個(gè)重要特征是與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中使用的常見化學(xué)物質(zhì)的相容性。由于其穩(wěn)定的C-C鍵，PMP顯示出優(yōu)異的耐化學(xué)性，特別是對酸、堿和醇的耐受性。PMP暴露于4%甲醛和0.1%Triton X-100進(jìn)行細(xì)胞固定和滲透，此外還暴露于Aerodesin 2000、70%乙醇和100%甲醇進(jìn)行滅菌。Aerodesin 2000由32.5重量%的丙-1-醇、18重量%的乙醇和0.1重量%的戊二醛組成。我們沒有觀察到PMP薄膜在暴露于任何這些化學(xué)物質(zhì)后有任何明顯的劣化，也沒有觀察到其透明度有任何變化。這同樣適用于所測試的物理滅菌方法，即等離子體處理、紫外線照射和蒸汽滅菌。事實(shí)上，PMP是一種注定要用于需要蒸汽滅菌的應(yīng)用的材料，因?yàn)槲史浅５?，因此無法觀察到水解引起的尺寸變化。

圖6顯示了除DAPI核染色外，用抗HIF-1α抗體和Alexa 488標(biāo)記的二抗固定、滲透和熒光標(biāo)記的細(xì)胞的共聚焦圖像。這證明了PMP材料與固定和滲透化學(xué)物質(zhì)的相容性及其對熒光成像的適用性。DAPI和Alexa 488熒光分別在358/461 nm和488/520 nm處具有激發(fā)/發(fā)射最大值；然而，根據(jù)三井化學(xué)股份有限公司的說法，PMP的透明度應(yīng)允許在整個(gè)可見光范圍內(nèi)獲得與玻璃類似的結(jié)果，并且在紫外線范圍內(nèi)具有比玻璃更好的透射性。如圖5和圖6中的熒光圖像所示，我們沒有觀察到任何熒光團(tuán)與PMP膜的非特異性結(jié)合?；诖耍覀兛梢缘贸鼋Y(jié)論，PMP在化學(xué)相容性方面適用于長期微流控細(xì)胞培養(yǎng)裝置。

3.4.設(shè)備制造

在這項(xiàng)工作中，實(shí)驗(yàn)需要一種裝置，其中氣體流入受到透氣底壁的限制，而裝置的其余部分則由不透氣材料（PC）制成。為此，使用PSA手動對齊PMP薄膜并將其與銑削的PC基板層壓在一起（圖2）。這種簡單的原型制作方法產(chǎn)生了功能良好的概念驗(yàn)證設(shè)備。然而，對于許多OoC應(yīng)用，需要在PMP中制造整個(gè)器件，因此，需要替代的制造和粘合方法，例如銑削和注塑。

3.5.足夠的氣體滲透性以維持密封裝置中的細(xì)胞培養(yǎng)，而無需灌注培養(yǎng)基

在實(shí)驗(yàn)過程中，每天至少兩次通過顯微鏡監(jiān)測細(xì)胞生長。由于氧傳感器點(diǎn)覆蓋了腔室的中心，因此在密封設(shè)備時(shí)只能監(jiān)測腔室外圍的細(xì)胞，但在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第四天），打開設(shè)備檢查整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域。所有設(shè)備中細(xì)胞融合的發(fā)展情況相似，表明玻璃設(shè)備與PMP和PDMS設(shè)備中O2濃度的差異不是由PMP和PDSS設(shè)備中細(xì)胞數(shù)量較低引起的。

所有三種設(shè)備中O2濃度的趨勢都很明顯，并且隨時(shí)間的波動很小。在圖7中，繪制了實(shí)驗(yàn)精確測量值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。因此，結(jié)果中存在相對較大的標(biāo)準(zhǔn)偏差，特別是在帶有玻璃蓋玻片的設(shè)備的第一天。然而，相對較大的標(biāo)準(zhǔn)偏差不是由同一室內(nèi)O2濃度的時(shí)間依賴性波動引起的，而是由實(shí)驗(yàn)重復(fù)之間的差異引起的。

經(jīng)過四天的細(xì)胞培養(yǎng)和O2濃度監(jiān)測，打開所有裝置，固定細(xì)胞，使其透性，對HIF-1α進(jìn)行染色并檢查（圖6）。我們觀察到在帶有玻璃蓋玻片的設(shè)備中生長的許多細(xì)胞中HIF-1α的激活，根據(jù)O2濃度測量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)氧濃度降至約3%。在含有PMP的設(shè)備中生長的細(xì)胞中看不到這種激活，最終測量的氧濃度達(dá)到16%。這與Uchida等人的研究結(jié)果一致，其中在氧氣濃度降低的范圍內(nèi)，A549細(xì)胞中HIF-1α的水平在氧氣濃度為3%時(shí)首先上升。由于夾板阻礙了顯微鏡物鏡的進(jìn)入，因此無法在帶有PDMS薄膜的設(shè)備中獲得細(xì)胞的共聚焦圖像。

盡管PMP膜在當(dāng)前的工作中提供了足夠的氣體供應(yīng)，但這并不一定意味著這適用于用于微流體細(xì)胞培養(yǎng)和OoC的所有設(shè)備幾何形狀和細(xì)胞類型。根據(jù)Wagner等人的研究，哺乳動物細(xì)胞在培養(yǎng)中的氧氣利用率范圍為<1至350 >amol cell-1 s-1，取決于細(xì)胞類型、功能和生物學(xué)狀態(tài)。根據(jù)同一篇論文，本研究中使用的A549細(xì)胞的OCR為27 amol cell?1 s?1。每單位面積的細(xì)胞數(shù)量取決于細(xì)胞大小、生長特性，重要的是該設(shè)備是用于2D還是3D培養(yǎng)。PMP中氧氣的滲透性可能因不同等級的PMP而異，并可能受到聚合物原型方法的影響。裝置幾何形狀，即壁厚和由透氣PMP制成的裝置的百分比，在不同的應(yīng)用中也可能存在很大差異。因此，需要更多的研究來進(jìn)一步研究PMP對不同細(xì)胞類型、細(xì)胞培養(yǎng)形式和微流體裝置幾何形狀的適用性。Ochs等人的工作中發(fā)現(xiàn)了不同細(xì)胞類型影響的一個(gè)例子，其中測量了結(jié)合到不透氣氧氣傳感器箔上的2毫米厚COC、PMP和PDMS器件中的氧氣濃度。對于內(nèi)皮細(xì)胞，PMP和PDMS裝置的氧氣濃度均保持在15-16%，而在COC中，氧氣濃度在監(jiān)測的2小時(shí)內(nèi)降至12%。對于肝細(xì)胞，只有PDMS裝置維持了16%的氧氣，而PMP和COC裝置在2小時(shí)內(nèi)分別降至9%和4%。

為了更好地了解本項(xiàng)目開發(fā)的培養(yǎng)室模塊中不同細(xì)胞類型的PMP氣體供應(yīng)是否充足，進(jìn)行了分析。使用補(bǔ)充信息中提供的通過培養(yǎng)基（1）和PMP材料（2）的氧氣通量方程，我們將傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)中的氧氣通量與開發(fā)的培養(yǎng)室模塊中的氧氣流量進(jìn)行了比較。。計(jì)算表明，在常規(guī)96孔板中，通過PMP膜的氧氣通量分別是通過100μL和200μL介質(zhì)的10倍和20倍。100–200μL是96孔板中使用的標(biāo)準(zhǔn)體積范圍。這意味著，當(dāng)在2D標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基體積的常規(guī)孔板中培養(yǎng)時(shí)，任何具有足夠氧氣供應(yīng)的細(xì)胞系在開發(fā)的培養(yǎng)室模塊中類似培養(yǎng)時(shí)，都應(yīng)該有足夠的氧氣供應(yīng)。

4.結(jié)論

在這項(xiàng)工作中，我們評估了PMP材料的各種性能，并表明該材料非常適合長期細(xì)胞培養(yǎng)和OoC設(shè)備。最重要的是，我們已經(jīng)證明，在A549細(xì)胞培養(yǎng)4天的密封培養(yǎng)室中，PMP在供氧方面與PDMS具有相當(dāng)?shù)男阅?。對于這兩種材料，氧濃度穩(wěn)定在16%，而玻璃的氧濃度降低到3%。分析表明，在96孔板中，通過PMP薄膜的理論氧氣通量比通過100和200μL介質(zhì)的通量高10倍和20倍。因此，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)的任何2D細(xì)胞系在所提供的培養(yǎng)室模塊中都應(yīng)該有足夠的氧氣供應(yīng)。通過裝置材料本身的充足氣體供應(yīng)能夠使氧氣供應(yīng)與培養(yǎng)基灌注脫鉤，從而降低灌注速率并減少細(xì)胞上的剪切應(yīng)力。這最終允許更好地控制OoC設(shè)備中的細(xì)胞微環(huán)境。

我們還發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞在PMP膜和涂有聚-L-賴氨酸的玻璃蓋玻片上的細(xì)胞粘附、增殖、形態(tài)和存活率相似。我們首次展示了在PMP上生長的細(xì)胞的透射光圖像，證明了PMP的光學(xué)特性適用于非熒光活細(xì)胞成像。與PDMS相反，PMP由于其良好的光學(xué)性能和剛度，即使對于薄至0.125μm的薄膜，也非常適合高分辨率共聚焦顯微鏡。此外，我們發(fā)現(xiàn)PMP與物理和化學(xué)設(shè)備滅菌（蒸汽滅菌、等離子體處理、紫外線、乙醇、甲醇和Aerodesin 2000）、細(xì)胞固定（甲醛）和滲透以及熒光染色兼容。

總之，PMP對于用于長期細(xì)胞培養(yǎng)的微流體裝置具有許多優(yōu)點(diǎn)。隨著器件原型的進(jìn)一步發(fā)展，我們相信PMP將在未來幾年在該領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

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