腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤類型之一，占所有原發(fā)性腦腫瘤的近30%，所有惡性腦腫瘤的80%，中位生存時間約為12.5~15.0個月，手術(shù)切除、放療、烷化劑化療或靶向治療是腦膠質(zhì)瘤治療主要手段。盡管近年來腦膠質(zhì)瘤的生物學研究取得了很多進展，但并沒有顯著改善患者的治療效果。目前，多數(shù)研究采用傳統(tǒng)的細胞模型、腫瘤球體模型、以嚙齒類動物為代表的體內(nèi)模型評估藥物的有效性，但這些模型不能真實預測藥物在臨床治療的療效，候選藥物在Ⅰ期臨床試驗中的成功概率僅為3.4%，由于有效性不足和安全性差，最終階段的失敗率為54%。因此，迫切需要能夠真實反映人類腦膠質(zhì)瘤疾病特征、微環(huán)境及其對治療藥物的反應等特點的臨床前模型。

微流控芯片技術(shù)能實現(xiàn)在特定形狀的通道中精確操縱各種流體和化學參數(shù)，例如，營養(yǎng)物質(zhì)、流速、壓力、氧氣和pH值，提供可控的培養(yǎng)條件，從而仿真模擬人體組織和器官的微觀結(jié)構(gòu)和功能特征，在腦膠質(zhì)瘤相關(guān)研究如循環(huán)分離腫瘤細胞、藥物篩選、膠質(zhì)母細胞瘤進展和細胞定位、模擬腫瘤與血流、缺氧和血管生成之間的相互作用等具有廣泛的應用。筆者應用腦膠質(zhì)瘤細胞構(gòu)建了一種模擬腫瘤微環(huán)境的腦膠質(zhì)瘤微流控芯片模型，用兩種抗腫瘤藥物進行藥效驗證和模型評價，并進一步探究中藥半枝蓮提取液抗腦膠質(zhì)瘤的療效，以期為尋找治療腦膠質(zhì)瘤中藥及其活性成分篩選提供技術(shù)支撐。

2.方法

2.1細胞培養(yǎng)

人神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤細胞（U251）購自于美國ATCC公司細胞庫，用含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

2.2腦膠質(zhì)瘤芯片模型的構(gòu)建

使用Auto CAD軟件設(shè)計、標準光刻法制作了3個并列平行微流控通道結(jié)構(gòu)的U251微流控芯片模型，各通道間由微梯形柱結(jié)構(gòu)隔開，中間通道為腦膠質(zhì)細胞瘤通道，兩側(cè)為培養(yǎng)基或含藥物培養(yǎng)基通道，如圖1A所示。將密度為2×107 cells/ml的U251細胞混懸液加入腦膠質(zhì)瘤通道中，兩側(cè)通道加入培養(yǎng)基或含藥培養(yǎng)基，構(gòu)成2D培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤模型；3D培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤模型則與等體積的基質(zhì)膠（4℃）進行混合后，迅速將混合液加入腦膠質(zhì)瘤通道中，并將芯片置于培養(yǎng)箱中孵育30 min后，分別取20 μl預熱后的培養(yǎng)基加入兩側(cè)的微通道中。24 h后模型內(nèi)2D和3D培養(yǎng)的細胞狀態(tài)如圖1B所示，模型內(nèi)2D培養(yǎng)的細胞在芯片通道的底部貼壁生長，而3D培養(yǎng)的細胞則嵌在3D基質(zhì)中不規(guī)則地生長。

2.3芯片上細胞活力評價

采用Calcein AM/PI染色試劑盒評價芯片模型內(nèi)細胞的活力。首先，向介質(zhì)通道中加入PBS溶液，洗滌3次，每次持續(xù)5 min，以去除模型內(nèi)潛在的干擾物質(zhì)。在避光條件下，按照1 000∶2∶3（V/V/V）的比例將PBS、Calcein-AM和PI混合，制備成Calcein AM/PI染色工作液。取20 μl的染色工作液加入通道內(nèi)，將芯片放入溫度為37℃的恒溫箱中，孵育2 h。孵育結(jié)束后，使用PBS溶液輕柔沖洗通道，去除未與細胞結(jié)合的染色劑，重復3次，每次持續(xù)5 min。將處理好的芯片放置在熒光顯微鏡下進行觀察并拍照記錄（在490 nm的激發(fā)波長下觀察呈現(xiàn)綠色熒光的活細胞，545 nm的激發(fā)波長下觀察呈現(xiàn)紅色熒光的死細胞）。

2.4腫瘤微環(huán)境表征

室溫下用PBS輕柔沖洗芯片模型內(nèi)的細胞5 min，重復3次；加入4%的多聚甲醛固定細胞，靜置10 min。用PBS輕柔沖洗通道內(nèi)的多聚甲醛5 min，重復3次；使用0.1% Triton X-100對細胞通透處理5 min，PBS洗滌細胞3次，每次5 min。室溫下用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉細胞內(nèi)非特異性結(jié)構(gòu)1 h，使用重組HIF-1α抗體（1∶500）4℃孵育過夜，孵育完成后，使用PBS去除芯片模型內(nèi)殘留一抗。采用含Alexa Fluor 488熒光基團的二抗（稀釋比1∶1 000）室溫避光孵育1 h，用PBS沖洗殘留的二抗后，加入DAPI避光孵育3 min，再用PBS沖洗通道3次，置于熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。

2.5   U251芯片模型的活性評價

分別取適量陽性藥儲備液，使用完全培養(yǎng)基分別稀釋成濃度為2.5、5、10、20 μmol/L的DOC工作液和100、200、300、400 μmol/L的TMZ工作液。在芯片兩側(cè)培養(yǎng)基通道中分別加入20 μl藥物工作液，24 h后采用Calcein AM/PI染色試劑盒評價陽性藥在2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)條件下對芯片內(nèi)細胞活力的影響。

2.6芯片模型內(nèi)細胞凋亡實驗

采用線粒體膜電位檢測試劑盒考察不同濃度的陽性藥物對芯片模型內(nèi)細胞凋亡的影響。取20 μl的PBS加入培養(yǎng)基微通道，輕柔洗滌3次，每次間隔5 min。在避光條件下，將超純水、JC-1、JC-1染色液以160∶1∶40（V/V/V）的比例配制JC-1染色工作液。向介質(zhì)通道側(cè)加入20 μl染色工作液，將芯片放入細胞培養(yǎng)箱中，孵育2 h。孵育結(jié)束后，使用PBS溶液沖洗通道，去除未結(jié)合的JC-1染料，重復3次，每次間隔5 min。將芯片放置在熒光顯微鏡下進行觀察并拍照記錄，在490 nm的激發(fā)波長下，可以觀察到JC-1單體的熒光信號；525 nm的激發(fā)波長下，可以觀察到JC-1聚合物的熒光信號。

2.7基于U251芯片模型的中藥半枝蓮藥效評價

2.7.1半枝蓮的提取

精密稱取半枝蓮藥材細粉25 g（過5號篩），將其置于500 ml 75%乙醇中浸泡30 min，90℃加熱回流2次，分別提取2 h和1 h。合并2次的提取液，減壓濃縮，使用50%乙醇將濃縮液轉(zhuǎn)移至50 ml的容量瓶中，定容至刻度，即得濃度為500 mg/ml（藥材質(zhì)量/ml）的提取物濃縮液，備用。

2.7.2細胞毒性實驗

取200 μl過濾后的半枝蓮提取濃縮液（500 mg/ml），加入DMEM完全培養(yǎng)基，混勻得10 mg/ml含藥培養(yǎng)基溶液，依次稀釋得8、6、4、2、1、0.5、0.25 mg/ml含藥培養(yǎng)基溶液。

將細胞懸液按5 000個/孔接種到96孔板中，空白組不加細胞，置于培養(yǎng)箱孵育24 h，棄去各孔中的舊培養(yǎng)基，實驗組各孔中分別加入含有不同濃度的半枝蓮溶液0.25、0.5、1、2、4、6、8 mg/ml，每孔100 μl；對照組各孔中均只加入細胞培養(yǎng)液，每孔100 μl，每個組5個平行。培養(yǎng)箱孵育24 h后，向各組每孔中加入10 μl的CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱中避光孵育1 h，酶標儀檢測450 nm波長處各孔的A值。

2.7.3芯片模型內(nèi)半枝蓮的藥效評價

模型內(nèi)細胞活力評價：采用“2.7.2”項下毒性實驗得到的濃度，模型內(nèi)加入2 mg/ml半枝蓮提取液培養(yǎng)24 h后，采用Calcein AM/PI染色試劑盒考察2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)條件下半枝蓮提取液對模型內(nèi)細胞活力的影響。

模型內(nèi)細胞凋亡評價：模型內(nèi)加入2 mg/ml半枝蓮提取液培養(yǎng)24 h后，采用線粒體膜電位檢測試劑盒考察2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)條件下半枝蓮提取液對模型內(nèi)細胞凋亡的影響。

2.8統(tǒng)計學處理

采用Image J軟件計算熒光強度，GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用單因素方差分析，當P<0.05時，表示差異具有統(tǒng)計學意義。

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