摘要

腫瘤來源的循環(huán)外泌體 （TDE） 正在被作為信息和非侵入性生物標志物。然而，定量檢測TDE仍然具有挑戰(zhàn)性。在此，我們構(gòu)建了DNA四面體結(jié)構(gòu)探針（TSP）介導的微流控磁檢測系統(tǒng)（μFMS），為分析TDEs提供了一個快速、靈敏的平臺。構(gòu)建CD63適配體修飾的Fe3O4磁性納米顆粒（MNPs）形成磁性納米報告探針（MNRs）。微流控芯片由DNA TSP修飾的醛基功能化的玻璃和蛇形微通道設(shè)計的PDMS層制成。模擬血清與PBS在TDE檢測方面無顯著差異，表明了所構(gòu)建的μFMS系統(tǒng)在復雜生物系統(tǒng)中進行TDE分析的可行性。在成本、反應時間和操作程序方面，該μFMS有潛力被開發(fā)為癌癥診斷和治療的臨床即時檢測工具。

介紹

癌癥目前人類的主要死因，嚴重危害人類健康。外泌體是大多數(shù)癌細胞分泌的杯狀脂質(zhì)雙層膜囊泡（直徑 30-150 nm），含有生物活性脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)貨物。腫瘤來源的循環(huán)外泌體 （TDE） 通過癌細胞膜的向外膨脹釋放，并且可以通過傳遞不同的信號分子來介導細胞間通訊，參與癌癥中的各種生理和病理過程。越來越多的研究表明，組織和血清中有許多 TDE 可以被識別為早期診斷的癌癥生物標志物。在 TDEs5 表面發(fā)現(xiàn)了多種膜蛋白，例如膜運輸?shù)鞍祝≧abs、膜聯(lián)蛋白）、熱休克蛋白（Hsp 90、Hsp 70、Hsp60 和 Hsc70）和四跨膜蛋白（CD82、CD9、CD63、CD81）。其中，CD9 和 CD63 等四跨膜蛋白已被用作鑒定和分析 TDEs 的外泌體特異性標記物。

迄今為止，通過識別和結(jié)合外泌體表面的四跨膜蛋白，已經(jīng)開發(fā)了許多 TDE 檢測方法，包括熒光 、比色法、ELISA、表面等離子體共振 （SPR）、表面增強拉曼散射 （SERS） 和電化學。然而，由于檢測性能相對較低、操作復雜、成本高等缺點，這些方法尚未在臨床上得到應用。因此，開發(fā)一個靈敏、快速、自動化的TDE分析檢測平臺至關(guān)重要。、

最近，磁性生物傳感器已成為強大的分子分析診斷平臺，可測量包括 DNA、可溶性蛋白質(zhì)、外泌體和細胞在內(nèi)的靶標，具有固有的低背景噪聲和生物介質(zhì)中穩(wěn)定的信號等優(yōu)勢。一般來說，磁性納米材料（MNPs）、標記策略和磁力計是用于分子分析的磁性生物傳感器的關(guān)鍵因素。MNP，包括鐵氧體 MNP、鐵芯 MNP 和多核 MNP，由于其獨特的磁性和易于表面改性的特點，是傳感應用的有吸引力的材料。其中，鐵氧體MNPs因其高Msat（飽和磁化強度）值、低毒性等特點，在磁性生物傳感器中得到更廣泛的應用。粒徑是影響磁性生物傳感器檢測性能的因素之一，流體動力學直徑小于 50 nm 的 MNP 已被證明是理想的尺寸。磁性生物傳感器的常見標記策略包括聚類測定、夾心測定和直接標記。夾心磁標記是使用親和配體功能化MNP捕獲生物靶標的最廣泛使用的方法之一。親和配體與固定在固體基板表面的二級親和配體偶聯(lián)，將MNP帶到傳感器表面進行磁信號檢測。親和配體（如適配體）可以識別具有高親和力和特異性的靶標，已越來越多地用于與MNPs的偶聯(lián)。 各種類型的磁力計已被應用于測量用親和配體功能化MNP標記的生物靶標產(chǎn)生的磁信號，包括磁通門傳感器、超導量子干涉器件（SQUIDs）、光泵浦原子磁力計（OPM）、 磁阻 （MR） 傳感器、霍爾效應磁力計和感應線圈 。SQUID和OPM傳感器具有很高的檢測靈敏度，但它們在小型化和降低成本方面的潛力有限。磁通門傳感器、磁阻傳感器和霍爾傳感器已用于 POCT 檢測，但它們的檢測靈敏度有限?；诟袘€圈的磁性探測器具有易于小型化、集成化和低成本的優(yōu)點。將感應線圈與差分電路相結(jié)合，可以大大降低噪聲，提高磁探測器的靈敏度。例如，由感應線圈和差分電路組成的磁性傳感器陣列能夠以高靈敏度對磁性納米粒子進行空間成像。

微流控芯片可以將實驗室集成到單個芯片中，以實現(xiàn)快速和自動檢測，通過提供高通量和靈敏度與低試劑消耗的有吸引力的組合，使檢測和分析 TDE 成為可能。用于TDE檢測的微流控芯片通常由上蓋和底層基板組成。為了提高捕獲效率，微觀結(jié)構(gòu)通常設(shè)計在上層通道中，以提供較大的表面積。下層通常用作固定親和配體的固體底物，例如抗體和適配體。

近年來，自組裝DNA納米技術(shù)因其非凡的生物穩(wěn)定性和生物相容性而備受關(guān)注。三維 DNA TSP 已被引入用于檢測 DNA、microRNA、CTC 和 TDEs40。DNA TSPs通過共價結(jié)合，可以很容易地固定在固體底物上，具有優(yōu)異的可控性和高精度的取向，可以減少非特異性吸附，調(diào)節(jié)抗體和適配體等親和配體的分布和取向，從而提高檢測靈敏度。

在這項工作中，我們開發(fā)了一種微流控磁檢測系統(tǒng)（μFMS），通過將MNP、微流控芯片和基于感應線圈的磁探測器與DNA TSPs相結(jié)合，用于快速靈敏地檢測TDE。CD適配體修飾的 MNP 可以將捕獲 TDE 的事件轉(zhuǎn)換為磁信號，并以電壓信號的形式輸出。采用帶有差分放大電路的感應線圈來消除大部分背景噪聲。DNA TSP被引入并固定在醛修飾的載玻片上（圖S3），作為支架形成TDEs的捕獲結(jié)構(gòu)。帶有蛇形微通道的PDMS上層與載玻片緊密結(jié)合，并與磁性檢測裝置集成。對μFMS進行了研究和優(yōu)化，以自動、靈敏和快速分析從U2細胞系中提取的TDE。

結(jié)果與討論

μFMS的工作原理

μFMS通過三明治樣免疫測定法檢測TDE。DNA TSP通過胺和醛基之間的共價偶聯(lián)固定在醛官能化載玻片上（圖1a）。將SA和生物素-抗CD9依次注射到微通道中，形成DNA TSPs/SA/生物素-抗CD9結(jié)構(gòu)。TDE和MNR溶液通過入口泵入微流控芯片。在流經(jīng)蛇形混合微通道時，兩種溶液混合并發(fā)生反應。然后，DNA TSPs/SA/生物素-抗CD9捕獲結(jié)構(gòu)、TDEs和MNRs之間形成夾層結(jié)構(gòu)（圖1b）。之后，使用PBS沖洗MNR，然后將其收集到Eppendorf管中。由于我們使用的磁傳感平臺比在芯片上更能測量 MNR 產(chǎn)生的基于體積的磁信號，因此我們使用磁力計磁探測器測量了總 MNR（Voltage total MNRs）和沖洗后的 MNR（沖洗后的電壓 MNR）的電壓輸出信號。通過計算總電壓MNRs和沖洗后的電壓MNRs之間的差值，獲得了片上捕獲的TDEs（片上電壓MNR）的電壓輸出信號。

圖1

提取的 TDE 的表征

透射電鏡觀察從U251細胞系中提取的TDEs的形態(tài)。結(jié)果表明，TDEs具有典型的杯形膜結(jié)構(gòu)，平均尺寸為100 ~ 150 nm（圖2a），這與之前的報道一致。DLS結(jié)果表明，TDEs的平均尺寸在131 nm的峰值處（圖2b），證實了我們制備的樣品中存在TDE。WB 顯示了 CD63 和 CD9 標記蛋白的透明條帶（圖 2c），這表明 CD63 和 CD9 在 TDE 表面表達。NTA分析的TDEs大小分布和濃度顯示，從U251細胞系中提取的TDEs濃度為1.98×1011顆粒/mL，平均大小為131 nm（圖2d），這與DLS結(jié)果一致，證實了我們制備的樣品中存在TDEs，可用于進一步研究。

圖2

DNA TSP 和 MNR 的表征和優(yōu)化

進行SDS?PAGE分析，以證明通過PCR進行的DNA四面體。如圖3a（左）所示，與2個單鏈DNA（A，B）、2個雙鏈DNA（AB，CD）、2個三鏈DNA（ABC、BCD）、1個四鏈DNA（ABCD）和1個五鏈DNA（ABCDL）的圖像相比，凝膠電泳圖像表明DNA TSPs移動速度更慢，證實了DNA TSPs的成功形成。通過AFM的DNA TSPs的表面形態(tài)如圖3a（右）所示。AFM圖像中的三角形表明DNA TSPs組裝成功。

圖3

TEM證實了MNRs和TDEs相結(jié)合的可行性。如圖3b所示，在MNRs表面觀察到具有典型磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的TDEs（用紅色箭頭表示），表明MNRs成功捕獲了TDE。

適配體與MNPs的結(jié)合取決于MNPs上的羧基與CD63適配體的氨基之間的脫水縮合。透射電鏡（TEM）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）光譜和DLS觀察結(jié)果證實了MNPs與CD63適配體之間的偶聯(lián)。如圖3c（a）所示，在MNPs的FTIR光譜中觀察到580 cm?1 （Fe-O）和1642 cm?1 （C = O）處的兩個峰（黑色）。與CD63適配體孵育后，在MNRs（黑色）的FTIR光譜中清晰地觀察到1378 cm?1 （C-N）、1538 cm?1 （N-H）、2850 cm?1和2920 cm?1（烷基鏈中的CH2）處的另外四個峰。如圖3c（b）所示，DLS揭示的MNPs和MNRs之間的尺寸變化表明，MNRs的直徑（276.9 nm）大于單分散MNPs（52.5 nm）。透射電鏡顯示，圖3c（c）中的MNRs發(fā)生了輕微的聚集，而圖3c（d）中的MNPs表現(xiàn)出良好的單一色散性。以上結(jié)果表明，MNP表面可以與CD63適配體成功偶聯(lián)。

μFMS的構(gòu)建和TDE檢測實驗條件的優(yōu)化

微流控芯片的目的是固定TSP和捕獲TDE。PDMS蛇形結(jié)構(gòu)的尺寸為500 μm寬和120 μm深（圖S1），與直線結(jié)構(gòu)（扁平芯片）相比，提供了更大的表面積（圖S2），可以提高TDE的捕獲效率。此外，氨基修飾的DNA TSPs通過胺和醛基之間的共價偶聯(lián)很容易固定在醛官能化載玻片上。

μFMS的性能通過磁性納米顆粒溶液的濃度梯度進行校準（圖S5）。結(jié)果表明，產(chǎn)生的電壓信號與標準磁性納米粒子的濃度具有良好的線性相關(guān)性，線性回歸方程表示為Y = 0.2091X + 0.00283 （R2 = 0.9997），證明所構(gòu)建的μFMS系統(tǒng)能夠定量檢測MNR捕獲的TDE。

使用DNA TSP修飾的蛇形芯片和扁平芯片證實了μFMS中蛇形芯片對TDE檢測的有效性。蛇形芯片組的電壓信號高于扁平芯片組，這意味著芯片上捕獲的TDE更多（圖S6A）。

使用醛修飾的載玻片基板制成的微流控芯片驗證了基于DNA TSP的支架對TDE檢測的有效性，該芯片由雙鏈DNA（dsDNA）和TSP DNA固定的醛修飾載玻片基板組成。結(jié)果表明，DNA TSP組比dsDNA組具有更高的電壓信號，表明DNA TSPs具有更高的捕獲效率（圖S6B）。

TDE和MNR之間的孵育時間會影響分析過程。較短的孵育時間會導致 TDE 無法完全與 MNR 結(jié)合。較長的孵育時間可能會加重適配體對MNPs的非特異性吸收。μFMS中的流速會影響TDEs和MNRs之間的結(jié)合效率，低流速會增加樣品處理時間;然而，高流速會導致 TDE 和 MNR 之間的孵育不足。為了通過μFMS獲得更高的TDEs檢測性能，優(yōu)化了孵育時間和流速。

如圖4a所示，當TDE和MNR之間的孵育時間為10、30、60、90和120 min時，60 min可以達到最高的SNR（信噪比），這意味著微流控芯片上的TDE捕獲效率最高。因此，選擇60 min作為最佳孵育時間。

圖4

如圖4b所示，在最佳孵育時間（60 min）下，隨著流速的增加，信噪比信號增大，達到最高值并開始減小。在 20 μL/min 的流速下實現(xiàn)的最高 SNR 意味著可以獲得 TDE 的最高捕獲效率。因此，選擇20 μL/min作為最佳流速。

設(shè)計梯度實驗來優(yōu)化結(jié)合在MNPs上的CD63適配體濃度。如圖4c所示，當CD63適配體濃度從0.05 μM增加到3 μM時，CD63-FAM-MNPs的熒光強度逐漸增加，并在濃度為3 μM時變得穩(wěn)定，這表明負載在MNPs表面的CD63適配體濃度已達到飽和。因此，選擇3 μM作為本實驗的最佳適配體濃度。

用于TDE的μFMS的分析性能

優(yōu)化用于TDE檢測的μFMS的實驗條件后，在微流控芯片上分析從PBS溶液中不同濃度的U251細胞系中分離得到的TDE。隨著TDE濃度從1.98 × 103增加到1.98 × 107 particles/mL，MNRs的信噪比也隨之增加（圖5a）。MNRs的信噪比與TDEs濃度對數(shù)之間的曲線擬合顯示出良好的線性關(guān)系（圖5b）。相關(guān)方程表示為SNR = 0.11219lg[TDE]-0.03004 （R2 = 0.9965）。由于濃度為 1.98 × 103 個顆粒/mL 時的 SNR 明顯低于閾值，即空白信號加上三個標準偏差 （3 SD），因此獲得了 1.98 × 103 個顆粒/mL 的檢測限 （LOD）（圖 5b，插圖）。

圖5

我們的μFMS方法和其他報道的用于TDE檢測的微流控平臺如表1所示。與大多數(shù)其他工作相比，我們的μFMS具有易于小型化、集成化和低成本等優(yōu)點，可以滿足臨床POCT的要求。此外，MNPs、DNA TSPs和微流控芯片與磁性生物傳感器的結(jié)合，確保了該方法能夠?qū)崿F(xiàn)靈敏和快速的檢測能力。檢測復雜生物樣品中的外泌體

為了驗證μFMS對TDEs的臨床實用性，我們通過模擬臨床血清樣本評估了μFMS的檢測性能。從PBS溶液中U251細胞系中提取的TDEs與50%FBS和80%FBS模擬血清樣品的SNR沒有差異（圖6），這意味著我們構(gòu)建的μFMS可能是從真實臨床樣本中檢測TDEs的潛在分析方法。

圖6

回收率還用于評估制備的μFMS用于臨床樣本的可行性。所得結(jié)果分別為100%、106.83%和111.38%，表明我們的μFMS在復雜環(huán)境下對TDEs的檢測性能良好。

結(jié)論

在這項工作中，我們開發(fā)了一種 DNA 四面體介導的 μFMS，用于具有高靈敏度和特異性的 TDE 片上檢測。我們設(shè)計并制造了一種以PDMS為上層，玻璃基板為下層的微流控芯片。在玻璃襯底上合成和修飾DNA四面體納米探針以捕獲TDE。將微流控芯片與包含感應線圈的磁探測器和差分放大電路相結(jié)合。在驗證了DNA四面體納米探針和微流控芯片在μFM中測量TDEs的可行性后，確定了μFMS在優(yōu)化條件下的檢測性能，線性動態(tài)檢測范圍為1.98×103–1.98×107顆粒/mL，檢測限為1.98×103顆粒/mL。我們證明模擬血清系統(tǒng)和PBS緩沖液對TDEs的檢測結(jié)果沒有顯著差異。與其他TDE檢測策略相比，我們的μFMS在檢測靈敏度和時間方面表現(xiàn)出很大的優(yōu)勢。因此，我們開發(fā)的μFMS系統(tǒng)可以為無創(chuàng)液體活檢提供非凡的選擇，并有可能成為有用的POCT工具。

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