血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是由腦血管內皮細胞（brain microvessel endothelia cells，BMECs）和血管周圍細胞形成的物理和功能屏障。BBB 對分子從血液到腦組織的運輸具有高度的選擇性，對于維持大腦的正常功能穩(wěn)態(tài)至關重要，但也為藥物進入腦組織產生治療作用帶來了困難。因此，為了深入了解血腦屏障的結構和功能，了解化合物通過BBB 的滲透性，需要建立合適的BBB 體外模型。作為被廣泛使用的Transwell 方法和動物模型兩種，其中Transwell 雖然在很大程度上可以解決目前BBB 體外研究的一些問題，但是Transwell 無法模擬流體剪切力等人腦生理特點。動物模型耗時長、價格高，且與人類存在種屬差異。微流控芯片的發(fā)展為人體器官的體外模擬提供了新的方式。微流控芯片可以構建各種微結構，實現多種細胞的精確控制；采用注射泵控制微通道中流體的流動可以模擬人體內血流產生的剪切應力，這種剪切力可以誘導BMECs 的分化并可及時清除細胞代謝產物，為細胞生長提供一種與人體高度近似的環(huán)境。本文基于微流控芯片的BBB 體外模型按常規(guī)的微管道結構分為平面型和垂直型兩種，討論兩種體外模型的設計構建及其在炎癥反應、藥物篩選與遞送等領域的具體應用。旨在為BBB 體外模型研究提供新的工具選擇和思路。

血腦屏障的構成和功能

1. BBB 的構成 BBB 介于血液與腦組織之間，由BMECs、基底膜、周細胞、神經膠質細胞等構成。BMECs 與神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞、周細胞之間相互作用形成一個動態(tài)的功能單元，稱為神經血管單元，BBB 的形成和功能依賴于神經血管單元內密切的細胞間相互作用。其中，BMECs 之間可以形成一種物理屏障阻礙物質通過相鄰細胞之間的旁通道運輸；星形膠質細胞作為信號傳導的中介誘導BMECs 發(fā)揮屏障特性，并且為神經元提供營養(yǎng)物質，清除其代謝產物；還有相關研究證實，星形膠質細胞的Ca2+信號可以參與血管直徑的調節(jié)；周細胞可以嵌入微血管基底膜內并包裹內皮細胞，通過旁分泌的方式釋放信號分子，這些信號分子作用于BMECs 參與調控血管的形成。血管壁的組織發(fā)生，包括BMECs 與周細胞的聯(lián)系，需要星形膠質細胞的參與。

2 BBB 的功能 BBB 嚴格調控分子和離子在血液與腦組織之間的運輸，在大腦基本營養(yǎng)物質供應、腦組織代謝廢物外排及避免血液中有害物質對腦組織造成損傷等方面起到重要作用。BBB 的結構改變與中風、腦瘤等疾病密切相關，BBB 功能障礙也可能會導致神經退行性疾病的發(fā)生。BBB 對物質的選擇性阻礙作用在維持腦組織的營養(yǎng)物質運輸、限制有毒有害分子的轉運的同時也阻礙了某些藥物透過，導致中樞神經系統(tǒng)（central nervous system，CNS）藥物的生物利用度降低。為了深入了解BBB 的結構和功能特性，了解不同藥物和化合物通過血腦屏障的滲透性需要建立合適的體外模型。

常用BBB 體外模型的評價方法

1 跨內皮電阻 跨內皮電阻（trans-epithelial electrical resistance，TEER）是一種測量體外培養(yǎng)模型中內皮細胞和上皮細胞電阻的定量技術。通過測量TEER 值評價緊密連接的嚴整性，評估BBB 體外模型的屏障作用。體外模型的TEER 值應盡可能接近體內TEER 值，通常在1800～2000 ω·cm2范圍內，150～200 ω·cm2被認為是功能模型中可接受的最低TEER 值。

2 滲透性實驗 BBB 的主要功能是對物質的選擇性轉運，通過測量其體外模型的滲透性（檢測不同分子量的帶電示蹤劑在模型中的通透量）以評定模型的實用價值，高質量的模型應具有與體內相似的滲透性特征。評估滲透性時，選擇合適的分子很重要，常用示蹤劑有：異硫氰酸熒光素葡聚糖、埃文斯藍、熒光素鈉以及辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase）等。

基于微流控芯片的血腦屏障體外模型

微流控芯片是一種結合化學、物理、生物工程等多學科于一體的高效工具，具有低試劑消耗、高通量、易于集成的特點，目前可以實現多種人體器官體外模擬，例如肝芯片，腸芯片及組合芯片等。器官芯片使實驗人員能夠以可控的方式改變局部細胞、分子、化學、生物和物理參數，精準模擬人體內微環(huán)境并加以分析。由于微流體芯片在微尺度上提供了對細胞和流體的精確控制，并且使得多功能集成成為可能，已經被用于在各種實驗中模擬BBB微環(huán)境。

1 基于微流控芯片的BBB 體外模型的構建多數微流控芯片的制作以刻蝕技術為基礎，在單晶硅、玻璃等基底材料上刻蝕出不同的通道圖案制備陽膜，再利用模塑法結合高分子聚合材料制做而成。應用于微流控芯片制作的高分子聚合材料中因聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）具有光學透明，無毒，不易燃，具有較好的透氣性等優(yōu)良性能而被廣泛應用。按設計的微管道結構不同將基于微流控芯片的BBB 體外模型分為兩種:垂直型和平行型。

2 垂直型BBB 體外模型 垂直型微流控BBB 模型通常由兩個垂直放置的微流體結構組成，兩個微流體結構由生物膜分隔，分別形成血管腔室和腦組織腔室。這種設計允許交叉通道通過多孔膜連接，多孔膜起到物理屏障作用，將兩個腔室的細胞類型分開，同時仍然允許細胞間物質信號交流，并且在結構上更加接近在體情況。通過微通道控制細胞生存環(huán)境，模擬體內物質運輸形式，實現細胞與細胞之間及細胞與外界的物質交換滿足細胞存活和分化所需要的生理條件，如細胞與流體的體積比、流體流動所產生的剪切應力等。

蔣麗莉等設計了一種微流控芯片。該芯片設計為垂直雙層結構，中間用多孔聚碳酸酯膜分隔，上層培養(yǎng)BMECs，下層培養(yǎng)星形膠質細胞分別由兩套流路系統(tǒng)進行控制，以實現模擬在體情況的血腦屏障模型構建。研究人員通過透射電鏡觀測到上下兩層細胞均附著于透明的聚碳酸酯膜上，且上層（BMECs 側）可見緊密連接蛋白。檢測TEER 值和熒光素鈉滲透實驗表明該芯片能很好的模擬BBB 結構。Jeong S 等將兩片分別具有4 個微通道的PDMS 芯片的通道面對合，中間夾以多孔聚碳酸酯膜，在其兩側培養(yǎng)BMECs 和星形膠質細胞分別模擬血管和腦組織，在單個芯片上的形成16 個BBB 單元，允許在一個芯片上同時進行多達16 種不同的分析。通過測量TEER 值、右旋糖酐滲透性實驗以及免疫染色分析來評價屏障功能。實驗數據表明該模型形成了緊密的連接屏障，物質通透性也顯著降低，屏障性能良好。

同樣采用通道垂直排列的設計，Brown JA 等構建了一個更完善的BBB 體外模型。他們在上層通道培養(yǎng)BMECs，在下層通道同時培養(yǎng)神經元細胞、星形膠質細胞和周細胞模擬腦組織，采用可翻轉設計滿足在管腔中每個面都培養(yǎng)細胞的需要，以支持人腦神經元細胞、星形膠質細胞、周細胞和BMECs在立體空間的生長和發(fā)育。兩個腔室分別具有入口和出口以滿足流體灌注，模擬了人腦神經元生長所需的結構，提供了更加近似人腦的體外環(huán)境。雙重灌注特性允許對血腦屏障的任一側進行操作，以及將藥物和營養(yǎng)物分別輸送到血管或大腦腔室，有利于評估不同化合物的滲透性及其對血腦屏障本身的影響。

垂直型BBB 體外模型提供了人類腦組織相關細胞生長所需的結構并且為BBB 長期穩(wěn)定分化所需的細胞間物質交流提供了環(huán)境，因此可以滿足在BBB 的背景下進行神經系統(tǒng)基礎研究，為血腦屏障功能的建模和中樞神經系統(tǒng)藥物毒性和滲透性的測試提供了一個新的平臺。但此類模型依舊存在一定的局限性，聚碳酸酯膜是此類模型中使用最廣泛的膜，由于它是光學半透明的，在實驗過程中不具備通過光學顯微鏡觀察細胞的能力。并且這些人工膜的厚度與人體內基底膜的厚度相比相對較高，限制了細胞間相互的作用，使得不同類型的細胞難以建立直接接觸。

3. 平行型BBB 體外模型 平行型BBB 體外模型通常利用微柱或微通道陣列分隔兩個平行排列的微通道，這些微結構之間的間隙很小，足以阻隔兩側的細胞，從而允許構成血管和腦組織的細胞分別在每一側培養(yǎng)。微柱或微通道陣列取代了垂直型BBB 模型中多孔膜的使用，使兩側微通道中的細胞之間可以直接進行物理和生化交流。光學透明的PDMS 的使用，允許動態(tài)實時監(jiān)測和使用顯微鏡方法直接觀察BBB 的變化成為可能。

Deosarkar SP 等構建的BBB 體外模型具有平行排列的內外兩層結構，外層培養(yǎng)鼠BMECs 模擬血管，內層培養(yǎng)鼠星型膠質細胞模擬腦室，中間由一排并列微柱之間形成的3 μm 的間隙相通。血管通道的尺寸為200 μm×100 μm×2762 μm（寬×高×長度），其3D 幾何形狀和尺寸與體內微血管的大小和形態(tài)非常接近，為模擬體內流體剪切力創(chuàng)造了條件。ZO-1 的表達增加、和TEER 值增加以及熒光40 kDa 葡聚糖的滲透性降低證明該芯片可以形成具有功能性的BBB。該團隊還通過血管室和腦室之間的3 μm 多孔界面觀察到星形膠質細胞突起和/或末端，表明該設計允許在血管通道中培養(yǎng)的鼠BMECs和在腦室中培養(yǎng)的星形膠質細胞之間進行物理和生化交流，這對于形成更緊密的BBB 至關重要。Nguyen PQH 等利用PDMS 與塑料聚碳酸酯（plastic polycarbonate，PC）制備了混合彈性體-塑膠微裝置模擬BBB，芯片設計了3 個通道，中間通道的寬度和高度分別為500 μm 和100 μm，橫向通道的寬度和高度分別為800 μm 和100 μm。通道之間由排列的微柱分隔，每根柱子寬200 μm，高100 μm。于中間通道培養(yǎng)星形膠質細胞，橫向通道之一灌注星形膠質細胞培養(yǎng)基，為細胞提供營養(yǎng)，另一個側通道接種人臍靜脈內皮細胞（human umbilical venous endothelocytes，HUVECs）。緊密連接標記物ZO-1 的表達結果表明緊密連接形成，羅丹明phalloidin 染料實驗證實肌動蛋白絲的形成，使用熒光示蹤劑FITC-dextran 測試表明BBB 具有低滲透性，TEER測量值顯示該模型具有良好的跨內皮電阻。

BBB 構成復雜，不同的細胞成分之間相互作用、相互影響共同維持和調控其結構和功能的完整性。微流控芯片可以構建各種微結構，實現多種細胞的精確控制；采用注射泵控制微通道中流體的流動可以模擬人體內血流產生的剪切應力，這種剪切力可以誘導血管內皮細胞的分化，對于物質轉運至關重要；微流控芯片的物質傳輸能力可以及時清除細胞代謝產物，為細胞生長提供一種與人體高度近似的環(huán)境。垂直和平行型微流控BBB 體外模型在具有微流控芯片共有優(yōu)勢的基礎上又各具特點。與垂直型相比平行型在實時可視化動態(tài)過程監(jiān)測方面具有顯著優(yōu)勢。

4 基于微流控芯片的BBB 體外模型的應用許多傳統(tǒng)模型難以支持BBB 形成中涉及的所有細胞類型、缺乏成熟緊密連接形成所需的流體剪切力，多種細胞所需營養(yǎng)物或其它物質通過擴散的方式進行補給，無法及時排除細胞代謝產物導致細胞微環(huán)境與在體情況差異較大?；谖⒘骺匦酒腂BB 體外模型由于其結構優(yōu)勢可以克服以上問題，為模擬生理或病理條件下整個器官和器官系統(tǒng)的活動和反應奠定了基礎，為研究各種因素對BBB 的影響、腫瘤遷移機理、評估不同化合物的滲透性等研究提供有力平臺。以下將結合垂直和平行型微流體BBB體外模型不同的優(yōu)勢介紹基于微流控芯片的BBB體外模型的具體應用。

炎癥反應研究 有研究表明炎癥反應可以改變BBB 的結構、增加其通透性，并且這種改變會隨時間而進展。炎癥反應對BBB 結構的改變可能依賴于細胞因子的作用。相關研究證實脂多糖可以誘導細胞因子的激活和細胞損傷。Brown JA 等采用了一種垂直型雙腔微流控BBB 體外模型，研究BBB如何對兩種不同但重疊的神經炎癥驅動因子——脂多糖和一種由白介素-1β、腫瘤壞死因子α 和單核細胞趨化蛋白1，2 組成的細胞因子混合物做出反應。垂直型微流控BBB 模型提供了一種更加接近在體情況的結構，允許溫和的介質交換并且可以維持適宜的流體剪切應力，雙重灌注系統(tǒng)允許對血腦屏障的任一側進行操作。他們將脂多糖和細胞因子持續(xù)灌注于BBB 模型的血管側，并收集暴露前和暴露過程中的流出物樣本，通過代謝物分析來確定炎癥反應的關鍵途徑。結果表明，脂多糖對血腦屏障的通透性、細胞因子激活和代謝活性有時間依賴性的影響，他們發(fā)現炎癥刺激增加了BBB 的滲透性，減少了緊密連接的數量，并改變了代謝組學特征。

5 腫瘤遷移與治療 腦腫瘤是指中樞神經系統(tǒng)中不同類型的原發(fā)性和轉移性腫瘤且預后極差，通?；颊呱媛蕵O低。為了形成腦轉移，腫瘤細胞必須穿過BBB 進入大腦，其作用機制復雜。有研究表明，BBB 中的星形膠質細胞能夠促進腫瘤細胞的侵襲。

Xu H 等利用基于微流控芯片的BBB 體外模型檢測人肺、乳腺和黑色素瘤細胞的腦轉移及其對化療的反應。他們設計了一種由16 個獨立的功能單元組成平行微流控BBB 模型，每個BBB 單元由一個血管通道（血管室）和一個用于注入細胞外基質膠原或星形膠質細胞（腦室）的通道組成。模型的平行分隔通道設計使得操縱血管流動和將細胞和營養(yǎng)物獨立地輸送到血管室或腦室成為可能，并且方便直接用熒光電鏡進行觀察，允許以高分辨率和高通量的方式進行研究。通過免疫熒光分析證實了動態(tài)血流或星形膠質細胞共培養(yǎng)的存在可以顯著增加內皮細胞緊密連接蛋白（ZO-1，克勞丁-5）和粘附蛋白（VE-鈣粘蛋白）的表達。另外他們通過在血管室分別注入腫瘤細胞BEL-7402、A549、MDA-MB-231、M624 等，模擬惡性腫瘤細胞外滲的過程。通過免疫熒光染色觀察證實肺癌、乳腺癌和黑色素瘤細胞有能力跨越血腦屏障。Xu H 等等還利用上述模型測試了八種臨床相關化療藥物穿過血腦屏障的能力及其對膠質瘤細胞的細胞毒性作用。結果表明，當BBB 存在時，只有替莫唑胺（TMZ）能顯著誘導膠質瘤細胞凋亡。

6藥物篩選、遞送 基于微流控芯片的BBB 體外模型可以高度還原人體內微環(huán)境并且具有易于組裝、方便觀察的特點，可以使涉及中樞神經系統(tǒng)的藥物相關研究更加高效。

腫瘤學中的精確醫(yī)學需要針對個別癌癥患者定制治療策略，Wong AH 等利用平行型的微流控BBB 體外模型篩選針對癌細胞系和從人類原發(fā)性腫瘤分離的細胞的藥物。分隔通道配置使得操縱血管流動和將細胞及營養(yǎng)物獨立地輸送到血管或腦隔間成為可能，功能單元的并行設計有助于高通量的血腦屏障分析并且允許動態(tài)實時監(jiān)測和使用顯微鏡方法直接觀察BBB 變化。他們利用微流控芯片將單細胞分散在液滴中，并在藥物治療后24 h 內成像，通過乙錠同二聚體染色評估細胞活力。根據實驗結果為癌癥患者后續(xù)精準給藥提供參考。

目前，納米制劑給藥系統(tǒng)因其獨特的生物相容性和穩(wěn)定性而得到廣泛應用，BBB 結合納米技術有望對腫瘤藥物產生革命性的影響。將治療藥物封裝在納米粒子（Nanoparticles，NPs）中，利用其可以穿透血腦屏障的特性為治療藥物提供保護并將它們送到指定部位。Falanga AP 等使用平行微流體BBB 模型評估了一種新的用于中樞神經系統(tǒng)的納米藥物輸送載體，發(fā)現納米粒子與膜營養(yǎng)肽GH625 結合時更容易通過BBB。

7其他 除以上應用外，基于微流控芯片的BBB體外模型還可以用于其它方面的研究。Wang Y 等開發(fā)了一種微流體芯片來獲得人類誘導的多能干細胞（hiPS）衍生的腦器官樣細胞，以研究妊娠早期的神經發(fā)育障礙。Li Y 等構建了三維人體功能性BBB 檢測INPM（indoor nanoscale particulatematter，INPM）對大腦神經系統(tǒng)的潛在影響。Brown JA 等使用由人腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞共同培養(yǎng)而成的簡化微流控神經血管單元（NVU）模型研究阿片類藥物進入中樞神經系統(tǒng)的機制。

總結與展望

隨著對BBB 的研究不斷深入，BBB 體外模型的構建的工具也在不斷發(fā)展。微流控芯片結合化學、機械、生物等多學科為一體，可以模擬體內關鍵特征，包括流體剪切應力、細胞表型和緊密連接等，同時具有低試劑消耗、高通量、易于集成、設計靈活的特點。但目前的芯片器官模型往往過于復雜，需要高度專業(yè)化的設備。制作微流控芯片的材料在一定程度上限制了這種技術的發(fā)展，聚酯等化學吸收性差，PDMS 盡管應用廣泛，化合物的吸附卻使得它不適合與藥物相關的研究；用作支持細胞培養(yǎng)和屏障構建的基膜膠原蛋白和基質凝膠價格高昂。新材料的開發(fā)，更優(yōu)化的芯片設計將大力推動微流控芯片在體外血腦屏障模擬方向的發(fā)展?？傮w來說，微流控技術在體外模擬BBB 具有廣闊前景。

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