1.關(guān)于用于DNA分析的微流體的介紹

微流體為生物分析提供了許多優(yōu)勢(shì)：

1.整個(gè)生物過程集成并因此簡(jiǎn)化了最終用戶

2.高通量，多重和高度平行的分析

3.由于反應(yīng)時(shí)間較短和/或分離時(shí)間較短，分析速度更快

4.用于即時(shí)應(yīng)用的便攜式設(shè)備

5.試劑消耗低

6.每次分析降低全球成本

所有這些優(yōu)點(diǎn)已被廣泛用于細(xì)胞和分子生物學(xué)。本綜述介紹了微流體在后一領(lǐng)域的主要應(yīng)用及其眾多的DNA分析技術(shù)。

2.微流體DNA提取和純化

細(xì)胞裂解及其在微流體裝置中的應(yīng)用

細(xì)胞裂解可以通過幾種方法完成：化學(xué)裂解，熱裂解，超聲裂解，電裂解，機(jī)械裂解。

化學(xué)裂解是最常見的實(shí)驗(yàn)室工作臺(tái)方法，因?yàn)樗子谑褂枚鵁o需特定設(shè)備。

該方法可用于片上裂解，但試劑在芯片外儲(chǔ)存，然后通過外部流動(dòng)系統(tǒng)注入裝置中以進(jìn)行片上裂解，這使制造復(fù)雜化全集成的裂解系統(tǒng)。

熱裂解是PCR實(shí)驗(yàn)室芯片裝置的便利方法，因?yàn)榱呀馑璧臒嵯到y(tǒng)也可用于以下PCR步驟。實(shí)際上，先前已經(jīng)開發(fā)了幾種在芯片上集成這些熱裂解和PCR步驟的系統(tǒng)。熱裂解只是將細(xì)胞暴露在高溫下。大多數(shù)時(shí)候，熱電材料集成在芯片上。

來自Privorotskaya等，實(shí)驗(yàn)室芯片，2010

超聲裂解在微流體裝置中呈現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)，以避免在脈沖模式的局部加熱，從而保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，同時(shí)使一個(gè)簡(jiǎn)單的積分（不像化學(xué)裂解）。

超聲裂解使用超聲波振蕩細(xì)胞內(nèi)的空洞，直到它們崩解。微流體裝置主要使用集成的壓電傳感器來產(chǎn)生這種超聲波。

電裂解使用高電場(chǎng)，其可破壞細(xì)胞膜并因此誘導(dǎo)其裂解。由于電極易于集成，電裂解是微流體裝置中常用的技術(shù)。然而，該方法存在一些缺點(diǎn)，例如在高壓下可能的水電解并因此形成氣泡。有趣的是，電極也可用于細(xì)胞介電電泳以進(jìn)行上游細(xì)胞分選。

來自Medimoon網(wǎng)站

機(jī)械裂解可以在微流體裝置中以多種形式進(jìn)行。可以在微通道內(nèi)整合尖銳的微納米物體以破壞細(xì)胞膜和裂解細(xì)胞。通過使用例如高壓地震膜壓縮細(xì)胞直至其裂解，也可以使用壓力。也可以使用磁珠通過用旋轉(zhuǎn)的外部磁體拍打來裂解細(xì)胞。在這里可以觀察到，機(jī)械裂解需要非常特定的設(shè)置，這可能使它們?cè)谥T如芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)之類的更完整的設(shè)備中的集成變得復(fù)雜。

從Quora網(wǎng)站

DNA純化及其在微流體裝置中的應(yīng)用

大多數(shù)微流體DNA純化技術(shù)已經(jīng)適應(yīng)了在提取柱中制備的宏觀方法，并且在某些緩沖條件下（高度離子和具有適應(yīng)的pH）使用DNA吸附在二氧化硅珠上。在該DNA吸附后，用洗脫緩沖液（例如水的低離子緩沖液）從二氧化硅顆粒中釋放DNA。

因此，在微流體裝置內(nèi)，二氧化硅珠可以被機(jī)械障礙物或二氧化硅涂覆的磁珠阻擋，以便用磁鐵容易地阻塞這些顆粒用于洗滌和洗脫階段。

其他類型的官能化可用于磁珠（例如核苷酸）。

在毛細(xì)血管中使用壓力驅(qū)動(dòng)流動(dòng)的等速電泳也可用于有效分離DNA。簡(jiǎn)而言之，等速電泳使用DNA之間的不同離子遷移率，“慢”和“快”電解質(zhì)。必須選擇電解質(zhì)以使DNA具有中間DNA遷移率，并因此在施加電場(chǎng)時(shí)聚焦在界面處。甲壓力驅(qū)動(dòng)逆流可用于控制聚焦界面的位置。因此，可以容易地從粗制樣品中提取DNA。

來自Standford微流體實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站

3.微流體DNA電泳

電泳是由均勻電場(chǎng)引起的帶電粒子的位移?；旧?，由于DNA由于其糖 - 磷酸骨架而帶負(fù)電，因此它將在均勻電場(chǎng)的存在下向陽極電極遷移。具有較高分子量的DNA將較慢遷移，因此可以區(qū)分具有不同分子量的DNA。

電泳應(yīng)用

與較低程度的PCR一樣，DNA電泳分離具有許多應(yīng)用。

其中一個(gè)主要應(yīng)用是驗(yàn)證前一段中提到的PCR結(jié)果。DNA必須用嵌入劑如溴化乙錠或Sybr Green染色，然后在紫外光下觀察。通過電泳分離，通過大小分離DNA并與校準(zhǔn)的分子量梯進(jìn)行比較以檢查獲得的分子量并將其與預(yù)期的PCR結(jié)果進(jìn)行比較。即使分子量得到驗(yàn)證，分子序列也不會(huì)，這使得這種類型的檢測(cè)不如熒光探針的qPCR特異性。

電泳也可用于分析通過限制酶切割的DNA分子。這些限制酶在特定的限制性位點(diǎn)切割DNA。然后可以通過電泳分離不同的DNA序列，并根據(jù)所用的設(shè)備從電泳底物中回收，以將它們用作質(zhì)粒構(gòu)建的DNA序列模板（例如，質(zhì)粒是環(huán)狀DNA，通常合成為克隆載體或用于蛋白質(zhì)）生產(chǎn)）。

電泳也可用于DNA測(cè)序。該原則將在下一段中討論。

用于電泳的微流體裝置

電泳最初在凝膠中進(jìn)行，主要在瓊脂糖（對(duì)于較長(zhǎng)的DNA）和聚丙烯酰胺（對(duì)于較短的DNA）中進(jìn)行。這些凝膠是多孔的，這解釋了它們根據(jù)DNA大小/分子量降低了DNA電泳遷移率。

然后將電泳適應(yīng)于毛細(xì)管，其具有優(yōu)于凝膠的若干優(yōu)點(diǎn)。首先，它們能夠使用更高的電壓，從而減少分析時(shí)間。其次，由于它們具有大的表面積與體積比，它們有效地消散焦耳熱，這對(duì)于不產(chǎn)生溫度梯度以及因此可能干擾電泳效應(yīng)的對(duì)流效應(yīng)是重要的。電泳遷移率也取決于溫度，因此溫度梯度可能導(dǎo)致遷移區(qū)的遷移率和變形的空間依賴性。

隨著微流體技術(shù)的出現(xiàn)，DNA電泳成為第一個(gè)集成在芯片上的分子過程。這種小型化使得能夠進(jìn)一步增加處理時(shí)間以實(shí)現(xiàn)電泳（例如，在幾分鐘內(nèi)對(duì)數(shù)百個(gè)堿基進(jìn)行測(cè)序），減少試劑消耗并在芯片上組裝其他DNA處理步驟，如前所述?，F(xiàn)在，用于DNA電泳的微裝置分析已商業(yè)化。值得注意的是，壓力控制也可以與電動(dòng)力結(jié)合使用，以將DNA樣品注入分離通道內(nèi)。該技術(shù)能夠避免具有不同電子遷移率的物種之間的注入差異。

電泳微芯片中的樣品注入方法的實(shí)例。（a）浮動(dòng)注射，（b）雙T模式。改編自Dorfman等，Chemical Review，2012。關(guān)于這些注射方法的解釋可以在這篇優(yōu)秀的評(píng)論中找到。

4. DNA測(cè)序和微流體

測(cè)序是確定DNA序列的核苷酸順序的分析。首次測(cè)序是基于Sanger方法開發(fā)的。簡(jiǎn)而言之，  桑格方法基于PCR方法，但是，代替僅使用常規(guī)脫氧核苷酸（dNTP，參見PCR段落），標(biāo)記的雙脫氧核苷酸（ddNTP）也以低得多的濃度添加。與dNTP不同，ddNTP缺失3'羥基，這意味著當(dāng)它們?cè)诩?xì)長(zhǎng)DNA鏈的末端添加時(shí)，不能繼續(xù)伸長(zhǎng)。因此，通過與所有不同類型的dNTP（A，T，C，G）和較少的ddNTP進(jìn)行PCR反應(yīng)，用不同熒光團(tuán)標(biāo)記的ddNTP，具有不同長(zhǎng)度的DNA片段和對(duì)應(yīng)于不同核苷酸末端的不同熒光團(tuán)將是獲得。然后通過電泳鑒別這些DNA片段，并且不同的熒光團(tuán)將能夠光學(xué)區(qū)分不同的堿基并因此對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序。

桑格方法原理

微流體已被廣泛用于改善Sanger測(cè)序，特別是因?yàn)楦倪M(jìn)電泳和其他測(cè)序步驟（DNA純化和PCR）的整合（參見前面的段落）。下一代測(cè)序技術(shù)對(duì)應(yīng)于能夠?qū)崿F(xiàn)高通量測(cè)序的技術(shù)，從而大大降低其成本和持續(xù)時(shí)間。所開發(fā)的系統(tǒng)使用全球微納米技術(shù)，生物物理和生物化學(xué)技術(shù)而不是特別是微流體技術(shù)，即使毫無需毫安和微流體來容易地在消耗品內(nèi)運(yùn)輸和交換試劑。

在最著名的新一代測(cè)序系統(tǒng)中，我們可以通過合成技術(shù)，生命技術(shù)和使用半導(dǎo)體技術(shù)的Ion Torrent命名Illumina及其測(cè)序，Pacific Bio使用零模式波導(dǎo)進(jìn)行單分子實(shí)時(shí)測(cè)序，Roche及其454測(cè)序系統(tǒng)使用焦磷酸測(cè)序技術(shù)。

然而，微流體更直接地用于依賴最初基于微陣列的測(cè)序技術(shù)的其他系統(tǒng)中，即雜交測(cè)序?；旧希b定的序列暴露于大量短標(biāo)記探針（通常5至10個(gè)核苷酸），因此在洗去非雜交探針后光學(xué)檢測(cè)它們的雜交。研究的序列或探針可以固定在微陣列上。

通過將不同的標(biāo)記探針置于液滴中并將它們暴露于DNA序列，已經(jīng)應(yīng)用了相同的原理。然后通過掃描每個(gè)液滴?光學(xué)檢測(cè)雜交。已經(jīng)開發(fā)了微流體裝置以自動(dòng)制備測(cè)序文庫，即隨機(jī)片段化的DNA序列，然后將其用于以下測(cè)序步驟。用于自動(dòng)化文庫制備的裝置現(xiàn)在也由測(cè)序公司商業(yè)化。

用于Sanger測(cè)序的微流體芯片實(shí)驗(yàn)室采集熱循環(huán)，樣品純化和芯片電泳。來自Blazej等，PNAS，2006

5.關(guān)于用于DNA分析的微流體的結(jié)論

我們看到微流體技術(shù)在DNA分析中發(fā)現(xiàn)了許多重要且關(guān)鍵的應(yīng)用。

由于DNA分析所需的復(fù)雜程序和較長(zhǎng)的分析時(shí)間，微流體技術(shù)能夠集成芯片上的所有不同步驟，并大大縮短分析時(shí)間。然而，這種技術(shù)仍然需要在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中被廣泛接受，因?yàn)榕c常規(guī)方法相比，其成本目前相對(duì)昂貴。因此，它現(xiàn)在更多地用于需要高通量分析或非常靈敏的分析的實(shí)驗(yàn)室。