基本介紹與發(fā)展現(xiàn)狀

　　液態(tài)活檢技術(shù)自問世以來(lái)發(fā)展十分迅速，針對(duì)CTC、ctDNA和外泌體的分離、捕獲、富集、純化已經(jīng)開發(fā)出諸如免疫法、磁分選法、膜過濾法、ddPCR法、差速離心法等，而關(guān)于其鑒定、分析也涌現(xiàn)了許多前沿技術(shù)，正是這些技術(shù)的不斷涌現(xiàn)推動(dòng)了液態(tài)活檢一步步進(jìn)入臨床實(shí)踐。雖然液態(tài)活檢技術(shù)已經(jīng)取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但科研工作者對(duì)于其持續(xù)的優(yōu)化卻一點(diǎn)也沒有停止，從目前對(duì)液態(tài)活檢技術(shù)研發(fā)的趨勢(shì)來(lái)看，人們?cè)絹?lái)越傾向于研發(fā)自動(dòng)化、微型化和高通量化的儀器，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的手工操作方法存在步驟繁多、耗時(shí)長(zhǎng)久、人為誤差較大等問題，既不利于臨床樣本的大批量檢測(cè)也難以確立穩(wěn)定的富集效率和鑒別標(biāo)準(zhǔn)。所以，在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上充分地聯(lián)合其他檢測(cè)方法，在不增加整個(gè)檢測(cè)過程的復(fù)雜程度的同時(shí)實(shí)現(xiàn)多模式的綜合檢測(cè)，以完成高效、準(zhǔn)確、廉價(jià)的檢測(cè)應(yīng)是未來(lái)的開發(fā)研究重點(diǎn)。

　　目前關(guān)于CTC的檢測(cè)已經(jīng)出現(xiàn)了微流控技術(shù)、納米技術(shù)和單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，這些技術(shù)的出現(xiàn)在一定程度上加速了CTC檢測(cè)的自動(dòng)化進(jìn)程。尤其以微流控和納米技術(shù)為代表，其精準(zhǔn)的控制性能、高效的檢測(cè)效率和簡(jiǎn)單便捷的操作優(yōu)勢(shì)已經(jīng)助力其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域大放光彩。目前很多自動(dòng)化的檢測(cè)平臺(tái)均采用了該技術(shù)，下面分別介紹其各自的特性以及發(fā)展現(xiàn)狀。

微流控技術(shù)

　　微流控指的是使用微管道處理微小流體的系統(tǒng)所涉及的科學(xué)和技術(shù)，是一門涉及化學(xué)、流體物理、微電子、新材料、生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程的新興交叉學(xué)科。由于其具有微型化、集成化等特征，故微流控裝置通常又被稱為微流控芯片。微流控被認(rèn)為在生物醫(yī)學(xué)研究中具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V泛的應(yīng)用前景。目前的CTC芯片分選原理可以大概歸納為被動(dòng)分選與主動(dòng)分選兩大類。不同種類的細(xì)胞在尺寸、密度、形狀、可變形性及親和性等物理、生物特性上各不相同，依據(jù)這些不同的特性，被動(dòng)分選技術(shù)通過流道內(nèi)的微結(jié)構(gòu)或微流體對(duì)細(xì)胞施加作用，從而實(shí)現(xiàn)分離，一般具有通量高、不需要額外施加作用力場(chǎng)的優(yōu)點(diǎn)。這些分離方法主要包括微結(jié)構(gòu)過濾、場(chǎng)流及水力分選、確定性側(cè)向偏移、慣性分選、仿生分選及親和性分選等幾類。主動(dòng)分選技術(shù)通過外力場(chǎng)對(duì)樣品流中的細(xì)胞施加作用力，從而致使其分離，其分選精度往往高于被動(dòng)分選技術(shù)。這些分選方法主要包括介電泳分選、磁分選、聲分選、光分選等幾類。鑒于目前微流控技術(shù)還存在分選純度不高、通量偏低等問題，尤其是面向外周血中含量極低的CTCs 的分選，難以同時(shí)滿足高通量、高純度的分選要求。因此，研究人員多采取將被動(dòng)分選技術(shù)和主動(dòng)分選技術(shù)相結(jié)合的多級(jí)分選芯片以達(dá)到對(duì)稀有細(xì)胞的分選要求。

　　被稱為第二代CTC捕獲技術(shù)的微流控CTC芯片技術(shù)（CTC-Chip）展示出了其用于分離檢測(cè)CTC的極大潛力。CTC芯片是一張與標(biāo)準(zhǔn)載玻片尺寸相同的硅片作為固相支持物，上面排列了多個(gè)蝕刻特殊排列微單元。該方法非常靈活，可以與不同的CTC分選策略相結(jié)合，如各種不同的抗體都可以包被在固相支持物上，大大提高了敏感性和從全血中捕獲稀少細(xì)胞的得率，同時(shí)操作過程相對(duì)簡(jiǎn)單溫和，從而使分離到的CTC保持一定的活力。雖然目前的微流控CTC芯片在設(shè)計(jì)、加工工藝上更復(fù)雜些，但其良好的分選效果、輕巧的體積、較少的進(jìn)樣體積、較高的靈敏度和即用即棄的便捷特性正吸引越來(lái)越多的目光，是未來(lái)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的一個(gè)主要方向。

　　但是微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于稀有細(xì)胞分選仍然存在一定的不足，比如目前已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)CTC存在16種亞型，為達(dá)到較高的捕獲效率需要固定對(duì)應(yīng)的抗體，而有些抗體尚未實(shí)現(xiàn)商品化或者CTC不表達(dá)相應(yīng)的抗原就會(huì)造成漏檢；現(xiàn)階段微流控平臺(tái)仍依賴于特異性的免疫識(shí)別，還無(wú)法做到對(duì)CTC全亞型和CTM以及被白細(xì)胞包裹的CTC的捕獲，從外周血液中獲取極少的CTC仍存在較大的困難，并且需要耗費(fèi)一定的時(shí)長(zhǎng)以保障其能發(fā)生較為充分的免疫反應(yīng)，即便是基于抗原抗體吸附的方法仍不能完全避免CTC丟失的情況；而且微通道中微結(jié)構(gòu)的擠壓，高剪切流的流場(chǎng)，外加的電場(chǎng)都會(huì)對(duì)細(xì)胞的活性造成一定程度的損傷，對(duì)后續(xù)的分離培養(yǎng)造成困擾。

納米技術(shù)

　　近年來(lái)納米技術(shù)的飛速發(fā)展，已被成功應(yīng)用包括醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)等到眾多領(lǐng)域。納米顆粒具有獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)、化學(xué)、機(jī)械和物理性質(zhì)，這在解決醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的難題上起到了巨大的促進(jìn)作用。納米材料根據(jù)材質(zhì)和形狀不同可分為很多種，如金納米顆粒、磁納米顆粒、碳納米管、納米孔和微懸臂等。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，人們可獲得結(jié)構(gòu)可控、表面功能化的不同種納米材料，納米材料所表現(xiàn)出的小尺寸效應(yīng)、高比表面積等諸多不同于一般材料的特性，使血液中極少量的CTC 的捕獲成為可能。納米材料與納米結(jié)構(gòu)與CTC的高接觸幾率，也可以大大提高CTC的富集效率被廣泛用于CTC的富集和檢測(cè)。鑒于納米材料的諸多優(yōu)點(diǎn)，將納米顆粒應(yīng)用到CTC的檢測(cè)中具有非常巨大的潛力。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)

　　單細(xì)胞全基因測(cè)序技術(shù)及單細(xì)胞基因組學(xué)的發(fā)展，某種程度上解決血液CTCs數(shù)量稀少的難題，不需要獲得大量的CTC即可進(jìn)行基因組學(xué)的分析，能檢測(cè)更多藥效相關(guān)基因及分析耐藥機(jī)制，為CTCs的分子分型及靶向藥物治療提供更準(zhǔn)確的信息?；蚧蚧蚪M變異是腫瘤發(fā)生的根本原因，利用單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)，可以更精準(zhǔn)地獲取腫瘤細(xì)胞并深入分析，發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞差異，了解癌細(xì)胞的基因突變，鑒別腫瘤的來(lái)源、分析腫瘤生長(zhǎng)規(guī)律，為早期診斷腫瘤和開展腫瘤個(gè)體化治療提供指導(dǎo)。此外，腫瘤的異質(zhì)性是導(dǎo)致腫瘤耐藥的原因之一。從單個(gè)腫瘤細(xì)胞水平對(duì)腫瘤單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，找出一個(gè)腫瘤在單個(gè)細(xì)胞上的共同結(jié)構(gòu)，揭露每個(gè)腫瘤細(xì)胞的突變規(guī)律，為抗癌藥物研究、腫瘤靶向治療提供基礎(chǔ)。

總結(jié)與展望

　　目前，尚存在循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量稀少，與正常細(xì)胞的整體差異不是很明顯，且不同部位的腫瘤及不同病人的同部位腫瘤的性質(zhì)也可能有所不同；早期癌癥患者體內(nèi)的ctDNA難以富集足夠濃度，早期難以檢測(cè)發(fā)現(xiàn)；外泌體雖然性能穩(wěn)定，但目前研究還不充分等問題，這都增加了檢測(cè)的難度，也是未來(lái)需要解決的問題。但是隨著檢測(cè)手段的不斷進(jìn)步，檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性的逐步提高，技術(shù)瓶頸終會(huì)被突破，在可期的將來(lái)隨著技術(shù)的成熟，液態(tài)活檢各種方法聯(lián)合使用將在腫瘤早期篩查、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷以及產(chǎn)前診斷等領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，因?yàn)閱我坏臋z測(cè)方法已經(jīng)不能滿足臨床的需要，而越來(lái)越傾向于CTC、ctDNA和外泌體聯(lián)合輔助診斷，只有液態(tài)活檢的“三駕馬車”攜手并進(jìn)才能更好地推動(dòng)液態(tài)活檢真正走入臨床治療實(shí)踐，成為輔助診斷密不可分的一部分。

文章作者：楊昂