芯片雜交是DNA芯片技術(shù)中除DNA方陣構(gòu)建外最重要的一步。雜交時(shí)選擇的條件要使成千上萬(wàn)對(duì)的雜交反應(yīng)中的最大多數(shù)處于最佳狀態(tài)中，也就是說(shuō)要使得盡可能多的正確配對(duì)物都不遺漏(假陰性盡可能少)，有錯(cuò)配的雜交降低至最低(假陽(yáng)性盡量少)，這是非常難以達(dá)到的境界。

　　 目前雜交是提高芯片在實(shí)際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟之一。雜交條件的構(gòu)建要根據(jù)芯片的實(shí)際情況進(jìn)行最優(yōu)化。

　 　雜交反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受很多因素的影響，而雜交反應(yīng)的質(zhì)量和效率直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。這些影響因素包括：(1)寡核苷酸探針密度的影響。 低覆蓋率使雜交信號(hào)減弱，而過(guò)高的覆蓋率會(huì)造成相鄰探針之間的雜交干擾。(2)支持介質(zhì)與雜交序列間的間隔序列長(zhǎng)度的影響。研究表明當(dāng)間隔序列長(zhǎng)度提高到 15個(gè)寡核苷酸時(shí)雜交信號(hào)顯著增強(qiáng)。有研究表明，選擇合適長(zhǎng)度的間隔序列，可使雜交信號(hào)增強(qiáng)150倍。(3)雜交序列長(zhǎng)度的影響。在雜交反應(yīng)中經(jīng)常發(fā)生堿 基錯(cuò)配現(xiàn)象，區(qū)分正常配對(duì)的互補(bǔ)復(fù)合物與單個(gè)或2個(gè)堿基的錯(cuò)配形成的復(fù)合物，主要依賴于形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性不同，而雜交序列的長(zhǎng)度是影響復(fù)合物穩(wěn)定性的 一個(gè)重要因素，一般說(shuō)來(lái)，短的雜交序列更容易區(qū)分堿基的錯(cuò)配，但復(fù)合物的穩(wěn)定性要差一些;而長(zhǎng)雜交序列形成的復(fù)合物穩(wěn)定，而區(qū)分堿基錯(cuò)配能力要差一些。研 究表明，12、15、20個(gè)堿基產(chǎn)生的雜交信號(hào)強(qiáng)度接近，但15個(gè)堿基的雜交序列區(qū)分錯(cuò)配堿基效果最好。(4)GC含量的影響。GC含量不同的序列其復(fù)合 物的穩(wěn)定性也不同。(5)探針濃度的影響。以凝膠為支持介質(zhì)的芯片，提高了寡核苷酸的濃度，在膠內(nèi)進(jìn)行的雜交更象在液相中進(jìn)行的雜交反應(yīng)，這些因素提高了 對(duì)錯(cuò)配堿基的分辨率，同時(shí)也提高了芯片檢測(cè)的靈敏度。(6)核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。在使用凝膠作為支持介質(zhì)時(shí)，單鏈核酸越長(zhǎng)，則樣品進(jìn)入凝膠單元的時(shí)間越 長(zhǎng)，也就越容易形成鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)從而影響其與芯片上探針的雜交，因而樣品制備過(guò)程中，對(duì)核酸的片段化處理，不僅可提高雜交信號(hào)的強(qiáng)度，還可提高雜交速度。