作者：張洋子

當傳染性病毒傳播時，最好的解決方案是快速準確地檢測出傳染因子并分離載體以防止進一步傳播。因此，開發(fā)合適的快檢工具，迅速篩查具有各種病毒綜合征類型的患者并根據(jù)所鑒定的病毒采取必要的措施則是十分必要的。

目前，快速免疫分析已經解決了基于抗體的酶聯(lián)免疫測定方法的時間問題并提高了便利性，但仍然具有抗體依賴性問題并且準確性差。同時，高靈敏度、高準確度的聚合酶鏈式反應（PCR）已經成為實驗室環(huán)境中最廣泛使用的檢測方法。然而，該檢測系統(tǒng)依賴于PCR儀實現(xiàn)升降溫且檢測成本較高,不適合在現(xiàn)場及發(fā)展中國家普及。因此，考慮到將等溫擴增技術，如滾環(huán)擴增反應（Rolling circleamplification, RCA）集成到微流體平臺中，可以有效解決上述問題。

基于此，韓國高麗大學的Sehyun Shin教授及其團隊研制出一種新的微流體裝置（圖1），該裝置主要由一個樣品池、一個填充有瓊脂糖微珠的多通道以及一個注射器三部分組成。用于填充的瓊脂糖微珠已提前修飾上進行RCA反應的引物，當含有病原體靶標物質進入混合有RCA反應體系及墨水的樣品池，首先與其中的模板結合，形成封閉的啞鈴型RCA模板，隨后逐漸流入對應的微通道內，與引物雜交后開始RCA反應，一段時間后，充分擴增的DNA產物彼此纏結在微珠表面形成DNA水凝膠，促使微珠表面積顯著增加，相應的橫截面流動面積減小，從而阻止液體在微珠之間進一步流動（圖2）。注射器用于產生具有死體積的可變真空壓力。由于與樣品體積（25 μL）遠小于死體積（4.1mL），因此整個檢測過程中新產生的真空壓力不會發(fā)生顯著變化，從而不會對多通道之間造成任何干擾。

圖1 （a）實驗裝置；（b）微珠填充微通道的示意圖；（c）微珠填充微通道內顯微鏡圖像。

圖2  利用瓊脂糖微珠通過RCA反應形成DNA水凝膠示意圖

研究團隊首先對微珠的選擇以及引物修飾效果進行了優(yōu)化。如圖3所示，首先將引物分別修飾在聚苯乙烯微珠和瓊脂糖微珠，經過洗滌后，再加入修飾有熒光基團FAM的探針，使其與修飾在微珠上的引物互補配對，再次洗滌后通過熒光顯微鏡進行觀察。對二者的熒光強弱可以明顯看出，引物修飾在瓊脂糖微珠上效果更好。此外，還使用分別修飾有兩種引物的微珠進行RCA反應，瓊脂糖微珠表面獲得的水凝膠量更多，再次證明其較聚苯乙烯微珠更適用于本實驗。經分析，瓊脂糖微珠具有一定的彈性，裝載進入微通道離心后會發(fā)生形變，使微珠能夠最大化的充滿整個通道內，有助于RCA反應生成的產物更快達到阻隔染料前進的目的。

圖3  驗證引物分別固定在聚苯乙烯微珠和瓊脂糖微珠上

隨后，確定了這一裝置檢測病原體的檢測范圍。如圖4a所示，當樣品中沒有靶標時，不會促發(fā)RCA反應，因此，在微通道內沒有任何堵塞，此時的基本流動阻力為3.65 kPa，即檢測的背景值。將垂直軸上的壓力定義為打破微通道內微珠間形成DNA水凝膠的臨界壓力。當靶標病原體以0.01 pM的濃度存在時，通過微通道所需的壓力略微增加，但不具有統(tǒng)計學意義（p?<?0.05）。進一步升高病原體濃度至0.1 pM時，臨界真空壓力與對照組出現(xiàn)顯著差異（p <0.05）。隨著濃度繼續(xù)增大，與對照組的差異更為明顯。由此，首先計算出吸入壓力為5.06 Pa，即作為截至臨界壓力，并在此基礎上建立了濃度與壓力的校準曲線，計算出檢出限LOD為0.019 pM。

將病原體DNA濃度固定在1 pM，微通道內微珠填充管的長度固定在20 mm的條件下進一步優(yōu)化了RCA反應的時間。如圖4b 所示，在RCA反應15 min后出現(xiàn)顯著差異（p<0.05）。20分鐘后，臨界壓力與對照組（0分鐘）存在顯著性差異（p <0.001）。各種病原體的LOD和檢測時間相似。經分析，這些通過肉眼檢測獲得的實驗結果與之前的相關研究報道比較，最短時間從2小時減少到僅需15分鐘。

圖4 （a）病原體DNA濃度與施加壓力的關系；（b）孵育時間與施加壓力的關系（*:p?<?0.05, **: p?<?0.001）。

在優(yōu)化好的條件下，將研制的裝置用于實際樣品可行性檢測中。如圖5所示，樣品1含有埃博拉病毒和寨卡病毒病原體，因此墨水僅通過相應的通道。相類似的，包含登革熱和MERS病毒的樣品2也在此對應的微通道內發(fā)生RCA反應形成DNA水凝膠實現(xiàn)檢測。因此，本系統(tǒng)可以選擇性地和靈敏地可視化檢測混合傳染性病毒樣品。

圖5 使用微流控芯片進行實際樣品的檢測的結果（a）樣品1：登革熱和MERS；（b）樣品2：埃博拉和寨卡病毒。

點評：

1. 該團隊開發(fā)了一種微流控裝置，通過在微通道中填充的數(shù)千個微珠表面上形成DNA水凝膠，阻斷珠子之間形成的流動路徑，將靶標濃度與裝置內的壓力建立關系，實現(xiàn)15分鐘內輕松準確并且無需使用任何電動儀器或設備即可檢測多種傳染性病毒。

2. 研究中巧妙地設計了啞鈴型模板用于RCA反應，且將RCA用于微流控快速檢測裝置中的反應時間大大縮短，在現(xiàn)場篩查中有望進一步應用。

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