3  表面等離子體共振技術(shù)

3.1  表面等離子體共振技術(shù)的發(fā)展

表面等離子共振（Surface plasmon resonance，SPR）是指當(dāng)一束平面單色偏振光以一定角度入射到鍍?cè)诓ＡП砻娴谋咏饘倌ど习l(fā)生全反射時(shí)，若入射光的波向量與金屬膜內(nèi)表面電子的振蕩頻率一致， 光線即被耦合入金屬膜引發(fā)電子共振，即表面等離子共振。由于共振的產(chǎn)生，會(huì)使反射光的強(qiáng)度在某 一特定的角度大大減弱，反射光消失的角度稱為共振角。共振角的大小隨金屬表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結(jié)合物的分子質(zhì)量成正比。由此，在20 世紀(jì)90 年代發(fā)展了應(yīng)用 SPR 原理檢測(cè)生物傳感芯片( Biosensor chip) 上的配體與分析物作用的新技術(shù)。在該技術(shù)中，待測(cè)生物分子被固定在生物傳感芯片上，另一種被測(cè)分子的溶液流過(guò)表面，若二者發(fā)生相互作用，會(huì)使芯片表面的折射率發(fā)生變化，從而導(dǎo)致共振角的改變。而通過(guò)檢測(cè)該共振角的變化，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子間 相互作用的動(dòng)力學(xué)信息。雖然SPＲ篩選通量不及HTS和HCS，但其不需任何標(biāo)記，能在更接近生理溶液的環(huán)境中直接研究靶標(biāo)和分析物的相互作用，使之在藥物研究中占據(jù)著重要的一席之地。隨著商品 化SPＲ生物傳感器儀器技術(shù)的逐步成熟，儀器的管路系統(tǒng)、進(jìn)樣方式及檢測(cè)速度等也發(fā)生了巨大變化，從最初的單點(diǎn)單通道分析到多通道陣列式分析，在分析通量和數(shù)據(jù)質(zhì)量方面有了很大改進(jìn)。 近年來(lái)在藥物篩選領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。圖2 展示了不同時(shí)期SPＲ芯片的通路變化，其中A為一對(duì) 一模式，每個(gè)位點(diǎn)相互獨(dú)立，任何一個(gè)樣品只能流過(guò)其中某一個(gè)通道，通道間不能互為對(duì)照。B 是Biacore 3000 型芯片格式，4 個(gè)位點(diǎn)用管路相連，任何一個(gè)位點(diǎn)可以為其它3 個(gè)位點(diǎn)做空白背景的對(duì)照；C是Biacore T100 型芯片格式，1-2 通道和3-4 通道直接相連，使相鄰的兩個(gè)位點(diǎn)間距離明顯縮短， 對(duì)照效果更好，基線更平穩(wěn)；D是Biacore S51 的芯片格式，可以同時(shí)分別進(jìn)4 個(gè)樣品，任一通道均可 作為對(duì)照通道。G被襯為一次動(dòng)力學(xué)模式芯片，是 Bio-Rad ProteOn XPR36 的芯片格式，可以一次性 平行標(biāo)記6 個(gè)配體，芯片再旋轉(zhuǎn)90°，在垂直方向平行流過(guò)6 個(gè)分析物或者6 個(gè)不同濃度梯度的同一分 析物，一次進(jìn)樣可完成兩個(gè)分子間的動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)。

圖2  各種SPＲ傳感器的芯片格式

3.2  SPＲ技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用

隨著SPＲ技術(shù)檢測(cè)靈敏度的提高，SPＲ的檢測(cè)對(duì)象不再局限于大分子之間的相互作用，也可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)－小分子、核酸－小分子之間相互作用的檢測(cè)。由于SPＲ技術(shù)能夠直接反映兩個(gè)分子間相互 作用的強(qiáng)弱和動(dòng)力學(xué)模式，所以采用SPＲ方法可對(duì)蛋白化合物庫(kù)、小分子化合物庫(kù)等進(jìn)行篩選，假陽(yáng)性率大大降低。Geschwindner等采用 SPＲ 篩選以蛋白片段為靶標(biāo)的小分子活性化合物，比傳統(tǒng)檢測(cè)方法得到更多的活性物質(zhì)，且SPＲ方法的Z－factor( 為0.67) 遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法( 為0.37) ， 說(shuō)明SPＲ篩選方法所得結(jié)果更穩(wěn)定可靠。G 蛋白偶聯(lián)受體( GPCＲs) 是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的重要蛋白質(zhì)， 其拓?fù)錁?gòu)象為7 次跨膜的受體，同源性較低，當(dāng)膜外的配體作用于該受體時(shí)，該受體的膜內(nèi)部分與 G 蛋白相互結(jié)合，激活G蛋白。大多數(shù)的細(xì)胞激素和神經(jīng)遞質(zhì)細(xì)胞內(nèi)外的交流通過(guò)GPCＲ信號(hào)通路完成， 藥物作用于GPCＲs從而達(dá)到治療目的。迄今已發(fā)現(xiàn)作為治療藥物靶點(diǎn)的蛋白總數(shù)約500 個(gè)，而GPCＲs 靶點(diǎn)占其中受體的絕大多數(shù)。很多科研工作者先后進(jìn)行了用 SPＲ 技術(shù)篩選 GPCＲ 配體及藥物的研 究。本課題組利用ProteOn XPＲ36 儀器，建立了分別以 DNA、ＲNA 和 POT1 蛋白、Aβ 蛋白等為 靶標(biāo)的小分子藥物篩選模型，可對(duì)源源不斷新合成的化合物進(jìn)行初步的活性篩選，為化合物的進(jìn)一步 開發(fā)研究提供了非常有參考價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

4  微流控芯片技術(shù)

4.1  微流控芯片技術(shù)的發(fā)展

在毛細(xì)管電泳發(fā)展的基礎(chǔ)上，20 世紀(jì)90 年代Manz等提出了微全分析系統(tǒng)，即微流控芯片( Microfluidic chip) 或芯片實(shí)驗(yàn)室( Lab on a chip) ，它是將化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、 分離、檢測(cè)及細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小) 的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能 的一種技術(shù)平臺(tái)。經(jīng)過(guò)幾十年的飛速發(fā)展，微流控芯片系統(tǒng)的芯片制作、檢測(cè)器研制、加樣操作等 相關(guān)技術(shù)已日趨成熟并規(guī)?；鋺?yīng)用范圍覆蓋了醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域，在藥物篩選方面也得到了非常廣泛的應(yīng)用。并憑借其樣品及試劑消耗少、分析速度快、效率高、操作模式靈活多變，以及可在生理環(huán)境或接近生理環(huán)境下運(yùn)行等優(yōu)點(diǎn)，為大規(guī)模高通量藥物篩選提供了 絕佳的實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)。微流控芯片是最有可能滿足高通量篩選要求的新興技術(shù)平臺(tái)之一。

4.2  微流控芯片技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用

在微流控芯片上進(jìn)行藥物篩選，可大致分為分子水平、細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平3 大方面的藥物 篩選。在分子水平的藥物篩選中，美國(guó) Caliper Life Sciences 公司將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于藥物篩選領(lǐng)域，開發(fā)了微流控芯片實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)功能的 EZ Ｒeader 系列藥物篩選平臺(tái)，在不加中止試劑的情況 下檢測(cè)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)。用于實(shí)驗(yàn)的底物是帶有熒光標(biāo)記的多肽，底物在反應(yīng)體系中酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，其所帶的電荷也發(fā)生相應(yīng)的變化，利用底物和產(chǎn)物所帶電荷的不同，將二者在芯片通道中進(jìn)行分離，并分別檢測(cè)。在檢測(cè)過(guò)程中，96 或384 孔板中的反應(yīng)物通過(guò)芯片底部的吸樣針被吸入芯片通道。由于 在芯片的分離通道上施加了分離電壓，帶有熒光標(biāo)記的多肽底物和反應(yīng)產(chǎn)物由于電荷的不同而被分離， 然后在檢測(cè)窗口進(jìn)行檢測(cè)( 見圖3) 。在檢測(cè)每一個(gè)樣品時(shí)，可以同時(shí)看到底物和產(chǎn)物的信號(hào)。該系統(tǒng)可用于大規(guī)模的激酶抑制劑篩選。本課題組已在 EZ Ｒeader 平臺(tái)上開展激酶抑制劑的篩選研究。在細(xì)胞水平的藥物篩選上，微流控芯片也具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。它可以將細(xì)胞種植、培養(yǎng)、標(biāo)記、刺激、加藥、梯度稀釋等操作通過(guò)微通道網(wǎng)絡(luò)流體控制技術(shù)集成到一張芯片上完成，保持了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，可全面記錄細(xì)胞對(duì)藥物刺激的各種反應(yīng)。Ye 等構(gòu)建了一套用于細(xì)胞水平藥物篩選研究的集成化微流控芯片系統(tǒng)，芯片結(jié)構(gòu)的主體部分是由8 個(gè) 金字塔形的濃度梯度生成器網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圍繞一個(gè)公共的廢液池構(gòu)成，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)單次可產(chǎn)生64 種藥物作用條件，并獲得192種細(xì)胞生物信號(hào)。為了進(jìn)一步提高藥物篩選的準(zhǔn)確性，在體的藥物篩選越來(lái)越受到人們的重視，并且為了降低篩選成本，會(huì)優(yōu)先使用 一些模式生物來(lái)篩選藥物，如秀麗隱桿線蟲、斑馬魚胚胎等。微流控芯片則成為實(shí)現(xiàn)整體動(dòng)物水平藥 物篩選的良好平臺(tái)。本課題組在微流控芯片上建立了斑馬魚癲癇模型，研究了維生素C和苯 妥英鈉對(duì)斑馬魚幼魚癲癇的解救作用。此外，《分析測(cè)試學(xué)報(bào)》近期策劃的專題——— 《微流控技術(shù)在 分析檢測(cè)中的應(yīng)用》，對(duì)我國(guó)微流控技術(shù)在分析檢測(cè)領(lǐng)域的最新研究成果進(jìn)行了總結(jié)與集中報(bào)道，其中 也凸顯了微流控技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

圖 3  微流控芯片分離檢測(cè)酶產(chǎn)物和底物的示意圖

5  展  望

新藥開發(fā)，有助于治療人類所面臨的各種重大疾病，提高患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)壽命，而藥物篩 選則是發(fā)現(xiàn)新藥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。藥物篩選新技術(shù)的應(yīng)用，能更快速有效地從龐大的化合物庫(kù)中篩選出有 藥理活性的藥物，提高新藥開發(fā)速度，降低新藥研發(fā)成本。藥物篩選新技術(shù)之間的相互融合匹配將能 更好地達(dá)到藥物篩選的目的。比如HTS技術(shù)可借鑒HCS的成像系統(tǒng)，將檢測(cè)對(duì)象的反應(yīng)過(guò)程通過(guò)精密 數(shù)碼相機(jī)記錄下來(lái)，為藥物活性評(píng)估提供更全面的信息。HCS 的發(fā)展可更加切實(shí)地做到高內(nèi)涵篩選，

目前已發(fā)表的有關(guān)HCS論文中，60%～80%的文章只用到雙通道成像檢測(cè)細(xì)胞對(duì)藥物刺激的變化，離 多通道高內(nèi)涵檢測(cè)還有一定距離。經(jīng)過(guò)HTS和HCS 篩選的靶標(biāo)和藥物，可以采用 SPＲ 技術(shù)進(jìn)行二次篩選，以進(jìn)一步確證藥物的活性，降低藥物開發(fā)的投資風(fēng)險(xiǎn)。微流控芯片技術(shù)由于其微型化集成化的特點(diǎn)，有望集成HTS、HCS以及SPＲ篩選技術(shù)于一體，既能在分子水平評(píng)估藥物活性，也能在細(xì)胞水平監(jiān)測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的影響，從而更加全面完整快速地對(duì)藥物進(jìn)行篩選。毫無(wú)疑問(wèn)，隨著科技進(jìn)步及社會(huì)發(fā)展的需要，新的藥物篩選技術(shù)會(huì)不斷出現(xiàn)，各種新興技術(shù)各自發(fā)展又相互融合是未來(lái)藥物篩 選技術(shù)的發(fā)展方向，這將為新藥開發(fā)提供更強(qiáng)有力的技術(shù)支持，從而為人類的健康帶來(lái)福音。

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