EV在復(fù)雜的體液環(huán)境中體積小、密度低、分布廣，使得研究人員在分離和分析后獲得高純度EV極具挑戰(zhàn)性。這也限制了它們的臨床應(yīng)用?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了幾種新技術(shù)和商業(yè)產(chǎn)品來隔離EV。這些基于利用EV物理特性的分離原理，例如它們的密度、質(zhì)量和形狀。此外，還可以根據(jù)EV的理化和生化特性進(jìn)行分離，例如電荷、流體動(dòng)力學(xué)、溶解度和表面特性（蛋白質(zhì)）。已經(jīng)開發(fā)了幾種常規(guī)分離方法，每種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。因此，根據(jù)EV的不同特性，可以以單一或組合的方式進(jìn)行分離。

1、超速離心

超速離心（UC）是最常用的方法，也是目前EVs分離的金標(biāo)準(zhǔn)。在這種方法中，EV被分離，因?yàn)樗鼈兊某两迪禂?shù)與其他顆粒的沉降系數(shù)不同。簡(jiǎn)而言之，UC是一種差速離心方法，其中離心力逐漸增加，首先以2000-4000×g的低離心力去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片;去除凋亡囊泡、MV、生物聚合物等，濃度為10000-20000×g;并以100000-200000×g的高離心力沉淀外泌體。使用UC分離毛囊和脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的EV。在研究中，首先收集含有培養(yǎng)基的細(xì)胞，然后在2000×g和4°C下離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，然后將上清液以10000×g離心30分鐘。最后，使用第二上清液在以100000×g離心90分鐘后獲得EV。利用UC從前列腺癌細(xì)胞和正常前列腺上皮細(xì)胞中提取外泌體，他們開發(fā)了一種3D-SiO2多孔芯片用于小鼠腫瘤分期和前列腺癌的早期臨床檢測(cè)。然而，離心參數(shù)例如使用振蕩桶或固定角度轉(zhuǎn)子以及離心持續(xù)時(shí)間，會(huì)影響分離囊泡的產(chǎn)量和純度。結(jié)果表明，適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間可以提高外泌體中的蛋白質(zhì)和RNA產(chǎn)量，而僅靠轉(zhuǎn)速無法預(yù)測(cè)外泌體的造丸能力。

此外，UC會(huì)由于高離心力而對(duì)囊泡造成機(jī)械損傷，從而導(dǎo)致囊泡與實(shí)底血管之間的碰撞。這會(huì)降低分離外泌體的純度，并由于囊泡異質(zhì)性導(dǎo)致存在一些污染物蛋白質(zhì)聚集體。

2、密度梯度超速離心

密度梯度離心（DGC）是一種基于EV尺寸、形狀、質(zhì)量和密度的改進(jìn)超速離心方法。在密度梯度溶液中，當(dāng)每個(gè)顆粒的離心力與浮力平衡時(shí)，由于密度不同，不同的組分在從上到下的梯度中積累在不同位置。因此，外泌體可以與樣品中的其他成分分離。通常，蔗糖或碘二醇用于產(chǎn)生密度梯度。使用差速離心和額外的Optiprep?密度梯度超速離心提取水蚤原始小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的EV。使用質(zhì)譜法測(cè)定了分離的EV的蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)DGC的使用消除了污染物，并限制了分離過程中存在的蛋白質(zhì)聚集體和其他膜顆粒的共分離效果。使用DGC從人類唾液中分離EV，并將其與從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離的EV進(jìn)行比較。他們發(fā)現(xiàn)唾液EV的體積和密度分別為47.8±12.3nm和1.11g/mL，而細(xì)胞EV的體積和密度分別為74±23.5nm和1.06g/mL。因此，唾液EV的體積較低，密度較高。

DGC需要跨不同梯度的分離，并且需要時(shí)間在梯度中的每個(gè)點(diǎn)達(dá)到平衡。因此，此過程相對(duì)耗時(shí)且時(shí)間敏感，但操作相對(duì)簡(jiǎn)單。

3、體積排阻色譜

體積排阻色譜（SEC）是一種基于粒徑差異的分離技術(shù)。它也被稱為凝膠過濾。色譜柱中的固定相由多孔珠（例如，瓊脂糖、瓊脂糖、瓊脂丙烯酸和Biogel P）組成。當(dāng)添加樣品時(shí)，大顆粒無法進(jìn)入孔隙并被洗脫出來，在色譜柱中保留的時(shí)間較短。同時(shí)，小顆粒進(jìn)入孔隙，其洗脫速率顯著降低。因此，實(shí)現(xiàn)了分離。如何使用SEC從不同的生物體液中分離EV。注射器或帶有過濾器的空柱可用于設(shè)置SEC，同時(shí)在注射器的尖端放置尼龍網(wǎng)。隨后可以添加緩沖液以潤(rùn)濕過濾器并防止氣泡。隨后，可以加入所需體積的凝膠過濾基質(zhì)、填充洗脫緩沖液、潤(rùn)濕，最后使用。使用SEC從人體滑液中分離EV，并證明SEC可以通過超速離心耗盡EV濃縮后殘留的污染物。此外，使用高分辨率質(zhì)譜分析，他們發(fā)現(xiàn)蛋白酶K成功去除纖連蛋白和其他細(xì)胞外蛋白。由于脂蛋白顆粒的存在，很難從血液中分離EV。因此，將SEC與密度緩沖相結(jié)合，將脂蛋白顆粒與EV分離，同時(shí)將脂蛋白顆粒的污染減少100倍，從而提高EV的純度。比較了SEC和UC從尿液中提取外泌體方面，發(fā)現(xiàn)SEC在回收外泌體顆粒和蛋白質(zhì)方面優(yōu)于UC，提取的外泌體更多。相反，在UC過程中，發(fā)生破裂和不完全沉淀，導(dǎo)致外泌體蛋白回收率降低，外泌體顆粒明顯損失。將SEC純化的外泌體與EA.hy926和HCV29細(xì)胞系的外泌體進(jìn)行比較，在共孵育后4-6小時(shí)顯示出較高的內(nèi)化能力。

因此，與用UC提取的EV相比，使用SEC提取的EV具有更高的純度。然而，SEC在操作上更具挑戰(zhàn)性，需要額外的設(shè)備。

4、超濾

超濾（UF）的原理基于分子大小。該過程類似于傳統(tǒng)的過濾方法，因?yàn)檩^大的顆粒被過濾器保留，而較小的顆粒通過一個(gè)或多個(gè)具有不同孔徑或MWCO（分子量截止值）的膜。切向流過濾（TFF）也基于這一原理，是UF的高級(jí)形式。使用TFF從微藻中分離EV，截止值為650、200和20nm。為了提高樣品純度和產(chǎn)量，評(píng)估了不同的技術(shù)參數(shù)和條件，以提高EVs的分離。發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的基于TFF的生物工藝適用于大規(guī)模生產(chǎn)。比較了UC和TFF從MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)物中分離EV的情況。發(fā)現(xiàn)TFF在產(chǎn)量和去除單個(gè)大分子和聚集體方面更勝一籌。開發(fā)了一種優(yōu)化UF的方法，方法是引入0.22μm過濾器和MWCO為10000 kDa的透析膜，以去除大于200nm的細(xì)胞外微泡。使用離心超濾和100kDa MWCO納米膜過濾裝置從支氣管肺泡灌洗液中分離EVs，發(fā)現(xiàn)該過程提供的EV分布比UC和DGC更小，更均勻。與UC相比，UF和SEC將每毫升培養(yǎng)基回收小型EV的能力提高了約400倍。

然而，當(dāng)使用UF時(shí)，膜容易堵塞和剪切力，這會(huì)在過濾過程中破壞EV。然而，操作更簡(jiǎn)單。

5、場(chǎng)流分餾

用于場(chǎng)流分餾的分離裝置是一個(gè)薄而扁平的通道，高度為50–500μm。在垂直于樣品流的方向上施加力場(chǎng)，隨后聚焦在通道壁的一側(cè)，其中顆粒由于其不同的尺寸而與壁保持不同的距離。離側(cè)壁較遠(yuǎn)的較小顆粒在較大顆粒之前被洗脫。有不同類型的外部場(chǎng)，如電場(chǎng)、重力場(chǎng)、溫度場(chǎng)和錯(cuò)流場(chǎng)，它們可用于根據(jù)其生物物理特性分離樣品。其中，研究最廣泛的是非對(duì)稱流場(chǎng)分餾（AF4）中的錯(cuò)流場(chǎng)。AF4可用于從人血漿中的高密度脂蛋白（HDL）和脂蛋白顆粒（LDL）中分離EV，具有高純度和重現(xiàn)性。此外，他們發(fā)現(xiàn)人EV在人血漿中的濃度高于等體積的配對(duì)血清樣品，并且人血漿中EV量的個(gè)體差異與年齡和性別無關(guān)。最后，他們優(yōu)化了AF4技術(shù)和樣品制備工藝參數(shù)。使用流場(chǎng)-流分餾法根據(jù)Hb1.F3永生化人類神經(jīng)干細(xì)胞（HMSC）的不同流體動(dòng)力學(xué)直徑從Hb.F中分離濃縮外泌體。采用流場(chǎng)流分級(jí)法根據(jù)尿外泌體的大小進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者的外泌體幾乎是健康個(gè)體的兩倍。

然而，在該方法中，分離過程中的樣品量很小，因此不允許進(jìn)行大規(guī)模的分離和提取。此外，還需要事先分餾和濃縮。然而，該技術(shù)具有很高的重現(xiàn)性和分辨率。

6、沉淀法

聚合物沉淀法涉及將相關(guān)生物流體與聚合物溶液混合，然后低速離心以促進(jìn)外泌體沉淀并獲得外泌體。加入不同分子量的50%聚乙二醇（PEG），使最終濃度達(dá)到6、8、10、12和15%PEG和75mM NaCl。在優(yōu)化方法后，最終選擇添加PEG6000和NaCl，以達(dá)到10%PEG和75mM NaCl的濃度。孵育8小時(shí)后，可除去大量牛血清蛋白。然而，研究表明，用PEG制備的EV樣品仍可能保留一定比例的非EV相關(guān)分子。在SEC步驟之前使用PEG從細(xì)胞培養(yǎng)基中沉淀外泌體可以提高常規(guī)SEC方法的分辨率，因?yàn)镻EG會(huì)沉淀可溶性蛋白質(zhì)。此外，基于聚合物的沉淀與SEC（Pre-SEC）方法相結(jié)合可以幫助分離分泌EV亞型的單個(gè)細(xì)胞類型。如今，基于聚合物共沉淀的商用試劑盒可用于EV分離。使用miRCURY?外泌體分離試劑盒從血漿中獲得豐富的EVs特異性miRNA。他們發(fā)現(xiàn)基于沉淀的方法不足以從血漿中純化含有EVs的miRNA貨物。雖然可以去除部分無囊泡miRNA，但無囊泡miRNA在該方法分離的血漿EV沉淀物中仍然占主導(dǎo)地位。比較了UC、PEG方法和兩種商業(yè)試劑盒（Exoquick和PureExo）從健康供體血液中分離gDNA-EV的性能。他們發(fā)現(xiàn)PEG方法可以提高gDNA產(chǎn)量，降低成本和時(shí)間。

除了基于聚合物的沉淀外，基于電荷的沉淀還可用于EV分離。使用帶正電荷的魚精子蛋白誘導(dǎo)血清、唾液和細(xì)胞上清液中的EV沉淀。當(dāng)使用35000Da PEG沉淀魚精子蛋白時(shí)，促進(jìn)了EV的重懸，并且沉淀EV的回收率比通過使用電荷超速離心獲得的EV更有效。沉淀法避免了對(duì)昂貴設(shè)備的需求，適用于從小型生物樣品中分離EV。使用硫酸銨進(jìn)行鹽析，從脫脂牛奶中分離EV，實(shí)現(xiàn)與UC相當(dāng)?shù)募兌群彤a(chǎn)量，而使用ExoQuick試劑盒分離的EV純度較低。他們還驗(yàn)證了EV作為治療載體的相關(guān)功能。

在沉淀方法中，聚合物的污染可能會(huì)降低純度。雖然這些套件價(jià)格昂貴，但它們易于操作且隨時(shí)可用。

7、微流體

通過微流控芯片對(duì)EV進(jìn)行分離定量，具有樣品體積小、檢測(cè)速度快、多通道檢測(cè)易于實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。設(shè)計(jì)了一種基于膜的微流控平臺(tái)，使用兩個(gè)膜過濾器進(jìn)行EV分離和計(jì)數(shù)，用于從血液中快速分離和定量EV。首次使用0.2μm聚碳酸酯膜進(jìn)行攪拌增強(qiáng)過濾以分離小型EV，分離率超過99%。氧化鋁膜上的CD63免疫染色顯示熒光標(biāo)記的CD63+EVs，可在顯微鏡下計(jì)數(shù)。通過分析熒光斑點(diǎn)尺寸分布，可以估計(jì)單個(gè)EV的外泌體蛋白表達(dá)。創(chuàng)建了一個(gè)基于親和捕獲的微流體平臺(tái)。它由兩個(gè)微流體芯片組成：一個(gè)馬蹄形混合器單元和一個(gè)魚陷阱形狀的微過濾器單元（魚陷阱），分別用于捕獲和洗脫純化。這些芯片可以組合使用或單獨(dú)操作，EV的捕獲、富集和釋放可以在5分鐘（100μL樣品）內(nèi)完成。

通過微流體分離EV是近年來發(fā)展起來的一種相對(duì)較新的方法。由于自動(dòng)化、低樣品要求和程序的高通量性質(zhì)，它逐漸引起研究人員的關(guān)注。但是，需要解決有關(guān)大規(guī)模應(yīng)用的問題（降低制造和操作的復(fù)雜性）。

8、基于親和力的方法

基于化學(xué)親和力的EV分離已被廣泛研究?；谟H和力的方法可分為兩大類：目標(biāo)EV捕獲和非目標(biāo)EV捕獲。為了靶向捕獲EV，使用高親和力抗體、適配體和肽的組合靶向EV表面的各種生物分子。同時(shí)，非靶向捕獲使用脂質(zhì)探針、磷脂酰絲氨酸（PS）和TiO?；贓V表面脂質(zhì)的高親和力提取EV。使用傳統(tǒng)的球形免疫磁珠會(huì)導(dǎo)致較低的濃度和回收效率，因?yàn)榇胖榈谋砻婀饣蛣傂越缑嫘揎?。一種使用脂質(zhì)標(biāo)記和磁珠的新技術(shù)，首先插入脂質(zhì)基序DSPE-PEG1000-TCO，該基序標(biāo)記血漿中的EV，然后使用生物正交點(diǎn)擊化學(xué)將TCO標(biāo)記的EV固定在四嗪（TZ）接枝微球（小貼）上。然后通過離心分離小貼紙上的EV，最后使用逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR（RT-dPCR）分析EV中的mRNA。與基于免疫親和力的EVs標(biāo)記不同，基于免疫親和的EVs標(biāo)記受EVs表面特異性抗原（CD63、CD81、CD9）數(shù)量的限制，基于脂質(zhì)的EVs標(biāo)記物獨(dú)立于EVs表面抗原。這些標(biāo)志物與RT-dPCR同時(shí)組合可以量化尤文肉瘤和胰腺癌的致癌變化，證明其在監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和疾病進(jìn)展方面具有潛在的臨床價(jià)值。開發(fā)了免疫磁性刺猬顆粒（IMHP）來捕獲和釋放外泌體。這些顆粒用于從MCF-7細(xì)胞中捕獲外泌體，捕獲率高達(dá)91.7%。與通過UC獲得的外泌體相比，通過該方法獲得的外泌體保持了其結(jié)構(gòu)完整性并顯示出良好的生物活性。利用了富含磷脂酰絲氨酸的外泌體表面和SiO上的固定肽配體2微球誘導(dǎo)特異性相互作用并分離外泌體，并使用該方法從血清中分離外泌體。

使用DNA定向固定化（DDI）策略，通過固定與磁性顆粒上的囊泡結(jié)合的抗CD63抗體來分離EV。也就是說，使用互補(bǔ)寡核苷酸對(duì)表面和抗體進(jìn)行功能化，通過雙鏈DNA接頭的DNAse I催化酶促切割釋放EV。傳統(tǒng)方法基于通過加熱或超聲波破壞抗原抗體和改變其物理性質(zhì)，用有機(jī)溶劑、堿和其他化學(xué)方法處理可能會(huì)損壞EV。然而，所提出的可逆DNA連接可以允許在酶切后釋放EV，克服這個(gè)問題，同時(shí)增強(qiáng)對(duì)抗CD63抗體的親和力?；谂cEVs表面的靜電相互作用、物理吸附和生物識(shí)別相結(jié)合，制備了一種由乳鐵蛋白偶聯(lián)樹枝狀修飾的磁性納米顆粒組成的嵌合納米復(fù)合材料，無需離心和抗體親和力即可分離EV。EV可以在30分鐘內(nèi)從細(xì)胞培養(yǎng)物和臨床標(biāo)本中分離出來，但無法與其他類型的EV區(qū)分開來。

9、其他分離方法

使用電泳遷移和多孔膜從等離子體中分離EV，多孔膜由兩個(gè)電極之間并列的膜形成的三個(gè)流道組成。樣品在切向流中水平移動(dòng)，并在施加的電壓下垂直遷移。然而，尺寸>30nm的帶負(fù)電的EV無法通過孔并積聚在膜上，隨后用PBS洗滌膜以收集EV。使用瓊脂糖凝膠電泳從血漿脂蛋白中分離EV，該方法基于EV大小和zeta電位的差異。通過電泳回收的EV的形態(tài)與典型EV的形態(tài)一致。Naohiro一種使用陰離子交換制備外泌體的有效方法，其中細(xì)胞上清液首先通過0.22μm保留濾膜分離，然后使用陰離子交換柱層洗脫EV。該方法被證明最適合制備符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的EV以供臨床使用。

綜上所述，目前EV分離的方法多種多樣。但是，每種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。無論采用何種方法，重要的是考慮分離的EV是否完整，以及是否可以通過結(jié)合不同的技術(shù)來優(yōu)化分離和純化。因此，可以有效地分離高純度EV，同時(shí)去除不需要的物質(zhì)，確保安全并最大限度地降低成本以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模運(yùn)營。

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