4、探針的制備技術

探針（探針的功能是識別靶序列和攜帶報告分子，如同位素、熒光、地高辛等）：為了提高監(jiān)測靈敏度，人們的努力放在信號放大以及模板擴增兩個方面，其中應用經(jīng)過特殊處理的探針方法可以提高靈敏度的方法有三種：分支探針這種方法的原理是，設計具有龐大分支結構的分支核苷酸探針，分支末端以酶標記。這樣，經(jīng)過分支核苷酸與酶的雙重放大作用而將標本雜交時極弱的信號轉換為較強的化學信號。分子信標（Molecular beacon, MB，一種設計巧妙的熒光標記的核酸探針，未雜交狀態(tài)下為發(fā)夾結構，在發(fā)夾的兩端分別連接熒光素分子和猝滅分子，利用熒光共振能量轉移原理（FRET））、肽核酸（Peptide nucleic acids, PNA，以中性酰胺鍵為骨架，不帶電荷，為DNA類似物。與DNA的親和性高、酶解穩(wěn)定性好，因此多用來做診斷和檢測用探針）探針3項技術。

5、雜交反應及過程控制技術

芯片雜交是DNA芯片技術中除DNA方陣構建外最重要的一步。雜交時選擇的條件要使成千上萬對的雜交反應中的最大多數(shù)處于最佳狀態(tài)中，也就是說要使得盡可能多的正確配對物都不遺漏（假陰性盡可能少），有錯配的雜交降低至最低（假陽性盡量少），這是非常難以達到的境界。目前雜交是提高芯片在實際應用中的準確性的關鍵步驟之一。雜交條件的構建要根據(jù)芯片的實際情況進行最優(yōu)化。

雜交反應是一個復雜的過程，受很多因素的影響，而雜交反應的質量和效率直接關系到檢測結果的準確性。這些影響因素包括：（1）寡核苷酸探針密度的影響。低覆蓋率使雜交信號減弱，而過高的覆蓋率會造成相鄰探針之間的雜交干擾。（2）支持介質與雜交序列間的間隔序列長度的影響。研究表明當間隔序列長度提高到15個寡核苷酸時雜交信號顯著增強。有研究表明，選擇合適長度的間隔序列，可使雜交信號增強150倍。（3）雜交序列長度的影響。在雜交反應中經(jīng)常發(fā)生堿基錯配現(xiàn)象，區(qū)分正常配對的互補復合物與單個或2個堿基的錯配形成的復合物，主要依賴于形成的復合物的穩(wěn)定性不同，而雜交序列的長度是影響復合物穩(wěn)定性的一個重要因素，一般說來，短的雜交序列更容易區(qū)分堿基的錯配，但復合物的穩(wěn)定性要差一些；而長雜交序列形成的復合物穩(wěn)定，而區(qū)分堿基錯配能力要差一些。研究表明，12、15、20個堿基產(chǎn)生的雜交信號強度接近，但15個堿基的雜交序列區(qū)分錯配堿基效果最好。（4）GC含量的影響。GC含量不同的序列其復合物的穩(wěn)定性也不同。（5）探針濃度的影響。以凝膠為支持介質的芯片，提高了寡核苷酸的濃度，在膠內(nèi)進行的雜交更象在液相中進行的雜交反應，這些因素提高了對錯配堿基的分辨率，同時也提高了芯片檢測的靈敏度。（6）核酸二級結構的影響。在使用凝膠作為支持介質時，單鏈核酸越長，則樣品進入凝膠單元的時間越長，也就越容易形成鏈內(nèi)二級結構從而影響其與芯片上探針的雜交，因而樣品制備過程中，對核酸的片段化處理，不僅可提高雜交信號的強度，還可提高雜交速度。

6、雜交圖譜的信號檢測技術

雜交圖譜的信號檢測是生物芯片的兩個關鍵技術之一，目前關于芯片的大量專利和研究集中在這方面。熒光檢測主要有2種：激光共聚焦熒光顯微掃描和CCD熒光顯微照相檢測。前者檢測靈敏度、分辨率均較高，但掃描時間長；后者掃描時間短，但靈敏度和分辨率不如前者。雖然熒光檢測在芯片技術中得到了廣泛的應用，但是熒光標記的靶DNA只要結合到芯片上就會產(chǎn)生熒光信號，而目前的檢測系統(tǒng)還不能區(qū)分來自某一位點的熒光信號是由正常配對產(chǎn)生的，還是單個或2個堿基的錯配產(chǎn)生的，或者兼而有之，甚或是由非特異性吸附產(chǎn)生的，因而目前的熒光檢測系統(tǒng)還有待于進一步完善與發(fā)展。有研究者正試圖繞過熒光標記，建立新的檢測系統(tǒng)，以提高雜交信號檢測的靈敏度。

比較成熟的是采用激光系統(tǒng)掃描儀進行的熒光檢測，噪音水平、信噪比、分辨率是衡量掃描儀工作質量的幾個重要指標。由于熒光標記法的靈敏度相對較低，因此質譜法、化學發(fā)光和光導纖維、二極管方陣檢測、乳膠凝集反應、直接電荷變化檢測等等正作為新的芯片標記和檢測方法處于研究和試驗階段，其中最有前途的當推質譜法。

目前有很多廠商生產(chǎn)生物芯片信號檢測掃描儀，知名的公司包括：Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Molecular Dynamics、Genetic aMicrosystems公司、Axon Instruments公司等。其中GSI Lumonics 公司ScanArray 系列一直是生物芯片掃描檢測系統(tǒng)中的領頭產(chǎn)品。2000年GSI并入著名的Parkard公司后ScanArray的軟、硬件都得到進一步加強。

7、信號（信息）分析與解讀——數(shù)據(jù)分析

芯片雜交圖譜的多態(tài)性處理與存儲都由專門設計的軟件來完成。一個完整的生物芯片配套軟件應包括生物芯片掃描儀的硬件控制軟件、生物芯片的圖像處理團建、數(shù)據(jù)提取（mining）或統(tǒng)計分析軟件，芯片表達基因的國際互聯(lián)網(wǎng)上檢索和表達基因數(shù)據(jù)庫分析和積累。

從國際上生物芯片專利的按領域分布來看，62%的專利集中在數(shù)據(jù)分析領域，可見如何對生物芯片帶來的海量數(shù)據(jù)進行解讀、分析是生物芯片研究領域的焦點和重點。

對所讀取的數(shù)據(jù)的處理方面，目前已經(jīng)有許多數(shù)學統(tǒng)計的方法用于芯片數(shù)據(jù)處理與信息提取，應用最廣泛的是聚類分析（cluster analysis）、此外還有主成分分析(principal component analysis)、時間序列分析(time series analysis)等，但是還沒有一種最標準的統(tǒng)計方式。

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