所有的生物芯片技術(shù)都包含四個(gè)基本要點(diǎn)：芯片的制作、雜交或反應(yīng)、測(cè)定或掃描、數(shù)據(jù)處理。生物芯片的技術(shù)核心是芯片的制備及反應(yīng)信號(hào)的檢測(cè)。

1、芯片制備技術(shù)

目前制備芯片的方法基本上可分為兩大類：一類是原位合成(in situ Synthesis)；一類是合成后交聯(lián)(post-synthesis attachment)。原位合成是目前制造高密度寡核苷酸芯片最為成功的方法。在制備基因芯片時(shí)要考慮陣列的密度、再生性、操作的簡(jiǎn)便性、成本的高低等幾方面的因素。

具體而言，比較典型的DNA芯片制備方法有4種：第一種方法是Affymetrix公司開(kāi)發(fā)的光引導(dǎo)原位合成法，該方法是微加工技術(shù)中光刻工藝與光化學(xué)合成法相結(jié)合的產(chǎn)物。第二種方法是Incyte Pharmaceutical公司采用的化學(xué)噴射法，該方法是將合成好的核昔酸探針定點(diǎn)噴射到芯片上并加以固定化來(lái)制作DNA芯片。

第三種方法是斯坦福大學(xué)研制的接觸式點(diǎn)涂法。在DNA芯片制備中通過(guò)高速精密機(jī)械手的精確移動(dòng)讓移液頭與玻璃芯片接觸，而將DNA探針涂敷在芯片上。第四種方法是通過(guò)使用4支分別裝有A，T，G，C核昔的壓電噴頭在芯片上并行地合成出DNA探針。

光引導(dǎo)合成法與噴墨打印法、合成點(diǎn)樣法相比，最大的優(yōu)點(diǎn)是，它可以合成密度極高的陣列；但它的最大缺點(diǎn)是耗時(shí)、操作復(fù)雜，而且為保證在不同位點(diǎn)加上不同的單體，從而在不同的位點(diǎn)合成不同的探針，需要不斷更換不同的蔽光膜，對(duì)一個(gè)含25個(gè)堿基的探針的微陣列，一般需更換100個(gè)蔽光膜，需一天多的時(shí)間才能完成。

合成點(diǎn)樣法雖然芯片上探針的密度相對(duì)較低，每個(gè)樣品都要預(yù)合成、純化，在芯片制備前還需妥善保存合成的探針，但是它的最大優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便。目前很多公司采用這種方法來(lái)制備芯片。

2、樣品制備技術(shù)

生物樣品往往是各種組分的混合體，成分非常復(fù)雜，由于目前的檢測(cè)體系還不能檢測(cè)出未擴(kuò)增的標(biāo)記樣品，所以待測(cè)樣品DNA在雜交前一般都要進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，在擴(kuò)增的過(guò)程中，對(duì)靶DNA進(jìn)行標(biāo)記。

目前DNA樣品的擴(kuò)增一般是通過(guò)液相反應(yīng)來(lái)完成，但由于低濃度核酸很難檢測(cè)到，在溶液中通過(guò)PCR反應(yīng)獲得線性擴(kuò)增也很困難；另外，不同靶DNA對(duì)引物的競(jìng)爭(zhēng)，意味著某一序列的擴(kuò)增優(yōu)于其他序列。

為了解決上述問(wèn)題，一些公司正在研究新的方法。如固相PCR系統(tǒng)，該系統(tǒng)是將2種引物排列在丙烯酰胺膜上，與DNA樣品、PCR試劑混合，如樣品含有靶序列，則開(kāi)始擴(kuò)增反應(yīng)；通過(guò)這種固相PCR體系，可避免對(duì)引物的競(jìng)爭(zhēng)，同時(shí)也降低了遺留污染。

不過(guò)也有不少人試圖繞過(guò)樣品擴(kuò)增這一問(wèn)題，如 Mosaic Technologies 公司引入的固相 PCR 方法，引物特異性強(qiáng)，無(wú)交叉污染并且省去了液相處理的煩瑣； Lynx Therapeutics 公司引入的大規(guī)模并行固相克隆法 (Massively parallel solid-phase cloning) ，可在一個(gè)樣品中同時(shí)對(duì)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的 DNA 片段進(jìn)行克隆，且無(wú)需單獨(dú)處理和分離每個(gè)克隆。

在芯片飛速發(fā)展的今天，樣品制備已經(jīng)成為芯片發(fā)展的瓶頸所在。對(duì)于較大規(guī)模制作芯片的用戶，由于點(diǎn)樣樣品數(shù)目太多，即使采用高通量試劑盒還是不夠方便。

世界上聲譽(yù)卓著的核酸純化供應(yīng)商德國(guó)QIAGEN公司推出了全自動(dòng)核酸和蛋白純化工作站，該工作站有4個(gè)不同的自動(dòng)純化系統(tǒng)型號(hào)：BioRobot 8000，BioRobot 3000，BioRobot 9604，BioRobot 9600，加上QIAGEN優(yōu)質(zhì)的多種配套純化試劑盒--從質(zhì)粒、粘粒、RNA、血液基因組DNA、病毒DNA到蛋白，品種豐富，在歐美的生物醫(yī)學(xué)市場(chǎng)上掀起了一場(chǎng)革命，各大分子生物學(xué)中心、芯片中心、醫(yī)學(xué)中心爭(zhēng)相搶購(gòu)。

樣品獲得后要進(jìn)行標(biāo)記，目前樣品的標(biāo)記主要是熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記基本分為2種，一種是使用熒光標(biāo)記的引物，一種是使用熒光標(biāo)記的三磷酸脫氧核糖核苷酸。

目前常使用的熒光物質(zhì)有：熒光素、羅丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物分離的方法不同，標(biāo)記的方法也不同：進(jìn)行單引物標(biāo)記的，其擴(kuò)增產(chǎn)物通常由聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；

對(duì)一個(gè)引物用生物素標(biāo)記，另一個(gè)引物用熒光素標(biāo)記的，一般用親合素偶聯(lián)的磁珠捕捉其擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)變性處理使熒光標(biāo)記的產(chǎn)物解鏈。

此外，也有用生物素殘基標(biāo)記引物，將生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片雜交，洗滌后加入親合素連接的熒光物，通過(guò)生物素與親合素的結(jié)合及靶序列與探針的結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)，然后利用熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。

3、芯片點(diǎn)樣技術(shù)

點(diǎn)樣法是將預(yù)先通過(guò)液相化學(xué)大量合成好的探針、或PCR技術(shù)擴(kuò)增cDNA或基因組DNA經(jīng)純化、定量分析后，通過(guò)由陣列復(fù)制器（arraying and replicating device，ARD）或陣列點(diǎn)樣機(jī)（arrayer）及電腦控制的機(jī)器人，準(zhǔn)確、快速地將不同探針樣品定量點(diǎn)樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片等相應(yīng)位置上（支持物應(yīng)事先進(jìn)行特定處理，例如包被以帶正電荷的多聚賴酸或氨基硅烷），再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片。

點(diǎn)樣的方式分兩種，其一為接觸式點(diǎn)樣，即點(diǎn)樣針直接與固相支持物表面接觸，將DNA樣品留在固相支持物上；其二為非接觸式點(diǎn)樣，即噴點(diǎn)，它是以壓電原理將DNA樣品通過(guò)毛細(xì)管直接噴至固相支持物表面。打印法的優(yōu)點(diǎn)是探針密度高，通常1平方厘米可打印2,500個(gè)探針；缺點(diǎn)是定量準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使用壽命有限。噴印法的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命長(zhǎng)；缺點(diǎn)是噴印的斑點(diǎn)大，因此探針密度低，通常只有1平方厘米400點(diǎn)。點(diǎn)樣機(jī)器人有一套計(jì)算機(jī)控制三維移動(dòng)裝置、多個(gè)打印/噴印頭、一個(gè)減震底座，上面可放內(nèi)盛探針的多孔板和多個(gè)芯片。根據(jù)需要還可以有溫度和濕度控制裝置、針洗滌裝置。打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。

現(xiàn)在已經(jīng)有比較成型的點(diǎn)樣裝置出售，例如美國(guó)Biodot公司的“噴印”儀，以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”儀。這些自動(dòng)化儀器依據(jù)所配備的“打印”或“噴印”針將生物大分子從多孔板吸出直接“打印”或“噴印”于芯片片基上?！按蛴　睍r(shí)針頭與芯片片基表面發(fā)生接觸而“噴印”時(shí)針頭與片基表面保持一定的距離。所以，“打印”儀適宜制作較高密度的微陣列（例如2500點(diǎn)/cm2），“噴印”法由于“噴印”的斑點(diǎn)較大，所以只能形成較低密度的探針陣列，通常400點(diǎn)/cm2。點(diǎn)樣法制作芯片的工藝比較簡(jiǎn)單便于掌握、分析設(shè)備易于獲取，適宜用戶按照自己的需要靈活機(jī)動(dòng)地設(shè)計(jì)微點(diǎn)陣，用于科研和實(shí)踐工作。目前，除了在生物芯片研制方面享有盛譽(yù)的Affymetrix公司等個(gè)別公司使用原位合成技術(shù)制造芯片外，大多中小型公司普遍采用點(diǎn)樣技術(shù)制作生物芯片。

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