資料來源：遺傳, 2019, 41(7): 611-624 doi: 10.16288/j.yczz.19-051

病原微生物的快速檢測對疫情的預(yù)防控制至關(guān)重要。近年來,微流控技術(shù)與核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合,誕生了多種病原微生物等溫?cái)U(kuò)增微流控檢測技術(shù)。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了病原微生物核酸提取、擴(kuò)增與檢測一體化,并具備多重檢測、定量檢測等功能,具有對儀器依賴度小、對操作人員要求不高、樣本量需求小和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn),適合于在多種環(huán)境下的病原微生物快速檢測。本文將對目前基于核酸等溫?cái)U(kuò)增的病原微生物微流控檢測技術(shù)進(jìn)行簡述，以期為病原微生物的快速篩查提供更多的方案思路。

一、基于重組酶聚合酶擴(kuò)增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

2006年,Piepenburg等首次提出了重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)(recombinase polymerase amplification, RPA)。它是由重組酶(T4 uvsX)、聚合酶(Bsu)和單鏈結(jié)合蛋白(gp32)以及兩條特異性的上下游引物參與的等溫?cái)U(kuò)增。首先,T4 uvsX在輔助因子uvsY的作用下與引物結(jié)合形成核酸蛋白復(fù)合物,然后該復(fù)合物尋找與靶標(biāo)DNA的互補(bǔ)區(qū)域進(jìn)行雜交并置換下另一條單鏈,置換下的單鏈馬上被gp32結(jié)合防止其再與互補(bǔ)鏈雜交,最后T4 uvsX在ATP的作用下與引物解離,聚合酶Bsu與引物結(jié)合并沿模板進(jìn)行延伸(圖1)。該反應(yīng)在37~42℃下30 min內(nèi)可以獲得10的12次方拷貝的擴(kuò)增產(chǎn)物,其靈敏度可達(dá)到單拷貝,其擴(kuò)增產(chǎn)物長度在500 bp以內(nèi)最佳。對RPA產(chǎn)物的檢測可采用包括瓊脂糖凝膠電泳、熒光探針實(shí)時(shí)檢測、及側(cè)流層析檢測等多種方法。由于RPA反應(yīng)快速、靈敏以及恒溫條件溫和等特點(diǎn),因此易于與微流控芯片結(jié)合開發(fā)出對病原微生物的即時(shí)檢測(point-of-care testing, POCT)技術(shù)。

圖1   重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)基本原理

1：在重組酶作用下,引物與靶序列結(jié)合;2：引物與靶序列結(jié)合后置換下的單鏈被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合;3：在聚合酶作用下進(jìn)行延伸,同時(shí)置換下的單鏈被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合;4：同源雙鏈分離,持續(xù)延伸;5：形成新的雙鏈,并進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)。參考文獻(xiàn)[10]修改繪制。

二、基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)由Notomi等于2000年首次發(fā)表,該反應(yīng)原理如圖2所示。針對待測靶標(biāo)設(shè)計(jì)一對外引物F3、B3和一對內(nèi)引物FIP、BIP,在具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)作用下,引物沿模板發(fā)生延伸和鏈置換反應(yīng),產(chǎn)生長短不一的靶標(biāo)重復(fù)片段,該反應(yīng)通常在60~65℃進(jìn)行,1 h內(nèi)將待測靶標(biāo)擴(kuò)增109倍以上,靈敏度可達(dá)到檢測10拷貝的待測靶標(biāo)。通過額外引入一對環(huán)狀引物可顯著提升其檢測靈敏度并使反應(yīng)時(shí)間縮短至30 min內(nèi)。其擴(kuò)增產(chǎn)物可通過凝膠電泳、雙鏈嵌合染料、比濁法、鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)、pH響應(yīng)顯色、納米金可視化]等方法進(jìn)行檢測。鑒于LAMP靈敏度高、檢測方式多樣、反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn),近年來發(fā)展了很多LAMP微流控芯片,它們在進(jìn)樣方式、產(chǎn)物檢測方法等方面各有千秋,在病原微生物核酸檢測方面均具有較好的應(yīng)用前景。

圖2   環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增原理

A：LAMP外引物F3/B3和內(nèi)引物FIP/BIP與靶標(biāo)互補(bǔ)的6個(gè)區(qū)域,如其中F3與F3c互補(bǔ),B3與B3c互補(bǔ);B：起始結(jié)構(gòu)產(chǎn)物生成步驟,引物FIP通過F2區(qū)域與模板鏈F2c結(jié)合并進(jìn)行延伸,之后F3與靶標(biāo)F3c結(jié)合并進(jìn)行鏈置換反應(yīng),FIP延伸產(chǎn)物被替換釋放,釋放的單鏈末端形成環(huán)結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)3)。BIP和B3以相似的方式進(jìn)行,生成兩端具有環(huán)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物5。C：循環(huán)放大步驟,結(jié)構(gòu)5以自身為模板,從3°末端F1區(qū)域開始自引發(fā)DNA合成,同時(shí)FIP退火至環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的F2c區(qū)域并進(jìn)行延伸得到結(jié)構(gòu)6。結(jié)構(gòu)6以自身為模板延伸,置換下與結(jié)構(gòu)5互補(bǔ)的產(chǎn)物7。結(jié)構(gòu)7到結(jié)構(gòu)8再到結(jié)構(gòu)5與結(jié)構(gòu)5到結(jié)構(gòu)6再到結(jié)構(gòu)7類似。結(jié)構(gòu)9和結(jié)構(gòu)10分別由結(jié)構(gòu)6和結(jié)構(gòu)8生成。在環(huán)狀結(jié)構(gòu)與FIP/BIP引物的共同作用下生成含有多個(gè)重復(fù)靶標(biāo)序列的結(jié)構(gòu)11、12。

三、基于其他核酸等溫?cái)U(kuò)增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

1、基于其他核酸等溫?cái)U(kuò)增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification, RCA)是一種具有鏈置換活性DNA聚合酶催化的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng),需要一條鎖式探針與靶序列雜交后連接成環(huán)狀模板,引物與環(huán)狀模板匹配后在DNA聚合酶作用下沿環(huán)延伸并不斷置換先前產(chǎn)生的延伸鏈,最終產(chǎn)生重復(fù)的長單鏈DNA產(chǎn)物。

2、基于依賴核酸序列擴(kuò)增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

1991年,加拿大Cangene Corporation公司Jean Compton實(shí)驗(yàn)室首次提出依賴核酸序列擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)。該方法以單鏈RNA為模板,在恒溫條件下,通過逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和T7 RNA聚合酶以及正向引物和反向引物來模擬體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制機(jī)制對目標(biāo)RNA進(jìn)行擴(kuò)增],90min內(nèi)可以將靶標(biāo)擴(kuò)增至10的12次方,其產(chǎn)物長度為100~250 bp,靈敏度可達(dá)檢測單個(gè)拷貝的靶標(biāo)分子。

3、基于解旋酶依賴性擴(kuò)增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

在體內(nèi),DNA通過解旋酶、DNA聚合酶及各種輔助蛋白因子進(jìn)行復(fù)制,Vincent等[49]模仿這一過程開發(fā)出了體外解旋酶依賴性擴(kuò)增法(helicase-dependent amplification, HDA)。該方法原理是首先DNA雙鏈被DNA解旋酶(E. coli UvrD helicase)分離為單鏈并分別被單鏈結(jié)合蛋白(single strand DNA-binding protein, SSB)結(jié)合,之后兩條上下游特異性引物分別與模板雜交,在DNA聚合酶(exo- Klenow)的作用下延伸,合成新的雙鏈,在37℃條件下反應(yīng)1~2 h可獲得106倍的擴(kuò)增產(chǎn)物,其靶序列在400 bp范圍內(nèi)可以得到有效擴(kuò)增。

四、不同技術(shù)比較

核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)因其反應(yīng)條件溫和而倍受病原微生物檢測的青睞。雖然各種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在反應(yīng)體系組成、反應(yīng)條件、檢測方式等方面均各有優(yōu)劣(表1),但它們依然離不開核酸提取、擴(kuò)增與產(chǎn)物分析等步驟,如何簡化與集成這些繁瑣操作步驟成為病原微生物核酸現(xiàn)場快速檢測的關(guān)鍵。微流控芯片與核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的結(jié)合成功解決了這一問題。

表1   不同核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)比較

相信隨著微流控技術(shù)與核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)的發(fā)展,會(huì)出現(xiàn)定量性能更好、儀器依賴度更低、可分析未知病原微生物序列的核酸等溫?cái)U(kuò)增病原微生物檢測芯片技術(shù),使病原微生物即時(shí)檢測向著集成化、快速、高通量、多重篩查的方向發(fā)展。

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