當(dāng)前單細(xì)胞水平的研究越來越受到重視,已廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞的PCR擴(kuò)增、基因組測序和組織工程研究等領(lǐng)域。隨著腫瘤干細(xì)胞研究的不斷深入,單個(gè)腫瘤干細(xì)胞的有效分離和培養(yǎng)成為腫瘤干細(xì)胞發(fā)生的分子機(jī)制、侵襲和轉(zhuǎn)移、腫瘤干細(xì)胞的靶向治療以及與微環(huán) 境的相互作用等研究中需要迫切解決的難題之一。 因此,我們擬建立一套簡捷高效的腫瘤干細(xì)胞的單細(xì)胞分離技術(shù)和培養(yǎng)技術(shù),為相關(guān)研究提供技術(shù)支持。

目前,單細(xì)胞分離方法有4種:

(1)手工機(jī)械分離 法:在倒置顯微鏡下直接分離細(xì)胞,但易損傷細(xì)胞;

(2) 熒光流式細(xì)胞技術(shù)分離法:熒光激活流式細(xì)胞分離技術(shù)能夠有效獲得單個(gè)細(xì)胞,但是對(duì)流式細(xì)胞儀的性能要求較高,儀器價(jià)格高昂;

(3)激光顯微切割技術(shù):能夠從組織中分離單個(gè)細(xì)胞,但不適用于細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增,且需要操作者極其熟練地掌握切割技術(shù);

(4)顯微操控儀: 采用顯微操控技術(shù)從單細(xì)胞懸液中吸取單個(gè)細(xì)胞,但精細(xì)的操作以及貴重的儀器使研究者望而卻步。以上技 術(shù)的缺陷使之無法得到推廣應(yīng)用,于是有研究人員自行 改良了操作方法,如使用小號(hào)靜脈注射針及微量移液器 組合進(jìn)行單細(xì)胞分離[11],但是由于腫瘤干細(xì)胞粘附性 強(qiáng),分離時(shí)易損傷,效果依然欠佳。因此,我們通過實(shí)驗(yàn) 摸索和總結(jié),建立了一套有效防止腫瘤干細(xì)胞損傷的簡 易單細(xì)胞分離技術(shù),并可高效擴(kuò)增單個(gè)腫瘤干細(xì)胞。

單個(gè)腫瘤干細(xì)胞分離及其培養(yǎng)材料

DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco）、Accutase 酶(eBioscience);B27 添加劑,重組人表皮生長因子 (EGF)、重組人堿性成纖維生長因子(bFGF)均購自Invitrogen;白血病抑制因子(LIF)(Millpore);BJ-40 毛細(xì)玻璃管(北京正天易公司);人結(jié)腸癌 SW480 細(xì)胞系 來自 ATCC(美國組織培養(yǎng)保藏中心),由上海生物細(xì)胞 所提供。人結(jié)直腸癌干細(xì)胞 SW480-17 細(xì)胞由本課題組自行篩選凍存。

單個(gè)腫瘤干細(xì)胞分離及其培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法

①配制培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基由DMEM/F12、B27、 EGF(20 ng/ml)、bFGF(10 ng/ml)、LIF(10 ng/ml)組成。 1.2.2 制備單細(xì)胞分離裝置 BJ-40 毛細(xì)玻璃管(外徑 1.0 mm,內(nèi)徑 0.8 mm)置于 1 mol/L 鹽酸中浸泡 24 h,然 后用超純水連續(xù)沖洗,65 °C烘干,高壓滅菌備用。取出 細(xì)玻璃管在酒精燈外焰燒烤數(shù)秒,迅速拉成細(xì)絲狀制成 口吸管。取無菌塑料管 1 段(30~40 cm),兩端分別連接 滅菌的 10 μl 和 100 μl 吸頭,10 μl 吸頭連接口吸管,建立 口控毛細(xì)管單細(xì)胞分離裝置。

種植單細(xì)胞 SW480 用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸 液備用。應(yīng)用自制的口控毛細(xì)管單細(xì)胞分離裝置于顯 微鏡下吸取單細(xì)胞懸液然后種植于 96 孔板中,每孔中 加入 1 個(gè)細(xì)胞。

②免疫熒光檢測

取單個(gè) SW480 細(xì)胞無血清培養(yǎng) 30 d 后的克隆球,4%多聚甲醛固定 20~30 min,PBS 洗 滌,0.2% Triton X-100,室溫孵育 10 min,PBS 洗滌, 10%正常羊血清,封閉 30 min,吸取羊血清,CD133、 CK7 抗體標(biāo)記過夜,PBS 洗滌,熒光標(biāo)記二抗(FITC、 TRITC),室溫閉光孵育 1 h,PBS 洗滌,再在每皿內(nèi)加 5 μg/ml DAPI 染液核襯染 5 min,PBS 洗滌后熒光顯微鏡下觀察。

③兩種結(jié)直腸癌干細(xì)胞培養(yǎng)方式比較

挑選單個(gè)腫瘤干細(xì)胞克隆球消化后制成單細(xì)胞懸液備用。取 Corning 35 mm × 10 mm 的皿,加入 10 滴培養(yǎng)基,每滴 20 μl,再加入 2 ml 石蠟油,建立微滴培養(yǎng)池。應(yīng)用自制 的口控毛細(xì)管單細(xì)胞分離裝置于顯微鏡下吸取單細(xì)胞懸液然后在每個(gè)液滴用口吹出一個(gè)細(xì)胞,種植于石蠟油封閉的微滴培養(yǎng)基中。同樣方式吸出細(xì)胞分別種植于 96 孔板中,每孔中加入 1 個(gè)細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察細(xì) 胞生長30d。

④統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS13.0 軟件處理,計(jì)數(shù)資料 采用χ2檢驗(yàn),P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

單個(gè)腫瘤干細(xì)胞分離及其培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

無血清培養(yǎng)環(huán)境下單個(gè) SW480 細(xì)胞在 96 孔板中的克隆形成率為 1.04%(2/192)免疫熒光顯示克隆球中 CD133 高表達(dá),CK7 幾乎不表達(dá)而在血清培養(yǎng)環(huán)境下 則 相 反( 圖 1 )。

采用口控毛細(xì)管單細(xì)胞分離裝置(圖 2)共種植了 199 個(gè)微滴,微滴中單細(xì)胞的數(shù)量為 197 個(gè),單細(xì)胞分 離的有效率為 98.99%(197/199),未成功的兩個(gè)微滴均為 2 個(gè)細(xì)胞;另種植了2塊96孔板共192個(gè)孔,其中 單細(xì)胞的數(shù)量為 184,單細(xì)胞分離的有效率為 95.8%(184/192)。

兩種培養(yǎng)方式觀察比較(圖 3、4),第 1 次分裂發(fā)生的時(shí)間都集中在第 3 天,分裂的概率分別為:微滴培養(yǎng) 24.9%(49/197),96 孔板培養(yǎng) 20.1%(37/184),兩者無明 顯差別(P>0.05)。微滴培養(yǎng)第 2 次分裂的時(shí)間集中在 第 6 天,分裂概率為 20.3%(40/197),而在 96 孔板培養(yǎng)第 2 次分裂集中在第 5 天,分裂概率為 16.8%(31/184),兩 者同樣無明顯差異(P>0.05)。此后微滴中細(xì)胞分裂的 時(shí)間長于 96 孔板內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞。11.5%(22/197)的單 細(xì)胞在微滴中能夠持續(xù)擴(kuò)增 30 d;9.2%(17/184)的單細(xì) 胞能夠在 96 孔板中能夠持續(xù)擴(kuò)增 30 d,兩種培養(yǎng)方式 在維持單細(xì)胞持續(xù)擴(kuò)增上無明顯差別(P>0.05,圖 5)。

口控毛細(xì)管的單細(xì)胞分離裝置最初用于卵細(xì)胞移植,我們?cè)诖嘶A(chǔ)上簡化改造,建立口控毛細(xì)管腫瘤 干細(xì)胞單細(xì)胞分離裝置。該裝置材料容易獲得,不需要 專用設(shè)備。毛細(xì)玻管在輕烤后管口變得圓滑,口吸操作 力度輕柔可控,能夠有效降低分離吸取單細(xì)胞時(shí)所造成 的機(jī)械損傷。采用口控毛細(xì)管單細(xì)胞分裂裝置分離出 來的單個(gè) SW480 細(xì)胞能在無血清的培養(yǎng)環(huán)境中形成克 隆球,克隆形成率約為 1.04%,并且克隆球中 CD133 的 表達(dá)高而 CK7 的表達(dá)低,進(jìn)一步驗(yàn)證為結(jié)直腸癌干細(xì)胞。此種方法分離單個(gè)腫瘤干細(xì)胞以口控毛細(xì)管單細(xì) 胞分離裝置為依托,以無血清培養(yǎng)方式篩選腫瘤干細(xì) 胞,操作靈活、簡單快捷、便于推廣,不僅可以分離腫瘤干細(xì)胞,而且可用于從混合類型的細(xì)胞中挑取單一類型 細(xì)胞,具有很好的實(shí)用價(jià)值。

在單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中,我們選用了微滴培養(yǎng)法。微滴培養(yǎng)法最先由 Brinster 建立,應(yīng)用于卵細(xì)胞培養(yǎng)和胚胎發(fā)育研究。2010 年 Araki 等觀察研究了小鼠精 原干細(xì)胞在微滴中的培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)小鼠的精原干細(xì)胞同樣 可以在微滴中發(fā)生擴(kuò)增,而且此方法也可以用來培養(yǎng)其 他干細(xì)胞。

圖3 動(dòng)態(tài)觀察微滴中培養(yǎng)的單個(gè)腫瘤干細(xì)胞

圖4 動(dòng)態(tài)觀察96孔板培養(yǎng)的單個(gè)腫瘤干細(xì)胞

我們將結(jié)直腸癌干細(xì)胞作為研究對(duì)象,分別接種于微滴和 96 孔板。與傳統(tǒng)的 96 孔板培養(yǎng)相比,結(jié)直腸癌 干細(xì)胞在微滴及 96 孔板中均可獲得分裂增生,兩者在 分裂時(shí)間以及可持續(xù)分裂的細(xì)胞數(shù)量上無顯著差異。

但是微滴培養(yǎng)法在操作靈活性及觀察便捷性方面具有明顯優(yōu)勢:

(1)微滴培養(yǎng)技術(shù)可以全方位立體動(dòng)態(tài)觀察 目的細(xì)胞整個(gè)培養(yǎng)過程,并能在分裂的早期階段再次分 離單個(gè)細(xì)胞,操作簡便快捷,為腫瘤干細(xì)胞、腫瘤祖細(xì) 胞、移行擴(kuò)增細(xì)胞和成熟腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的動(dòng)態(tài)演變規(guī) 律和分子機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ);

(2)石蠟油液 封的培養(yǎng)微滴可以減少培養(yǎng)基的流失,保持微滴中的 溫度、pH 值的穩(wěn)定,特別是某些珍貴而稀少的培養(yǎng)基,能夠充分顯現(xiàn)微滴培養(yǎng)的優(yōu)勢,而 96 孔板長時(shí)間培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)液易蒸發(fā)而改變培養(yǎng)基內(nèi)環(huán)境,影響細(xì)胞生長; 

(3)因微滴置于培養(yǎng)皿中,能多角度靈活操作,而傳統(tǒng)的 96 孔板孔徑比較狹長,種植細(xì)胞時(shí)候有一定的難度和局 限。綜上所述,石蠟油封閉微滴培養(yǎng)法培養(yǎng)單個(gè)腫瘤干 細(xì)胞有其獨(dú)特的優(yōu)勢,可以做為培養(yǎng)單個(gè)腫瘤干細(xì)胞的首選。

圖5 兩種培養(yǎng)方式比較

因此,我們根據(jù)腫瘤干細(xì)胞的特性,建立了一套高效可靠的單個(gè)腫瘤干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法,該方法操作簡單、成功率高,便于推廣,可用于腫瘤干細(xì)胞的單細(xì) 胞研究。石蠟油封閉微滴培養(yǎng)法培養(yǎng)單個(gè)腫瘤干細(xì)胞有 其獨(dú)特的優(yōu)勢,可以作為培養(yǎng)單個(gè)腫瘤干細(xì)胞的首選。