聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無(wú)論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對(duì)。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。由1983年美國(guó)Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到如今2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。1973 年，臺(tái)灣科學(xué)家錢嘉韻，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻(xiàn)。

一、遇到的問(wèn)題

1. cDNA產(chǎn)量的很低

可能的原因：

RNA模板質(zhì)量低

對(duì)mRNA濃度估計(jì)過(guò)高

反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足

同位素磷32過(guò)期

反應(yīng)體積過(guò)大，不應(yīng)超過(guò)50μL

2. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒(méi)有條帶或條帶很淺

最常見(jiàn)的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系

與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)

建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA

第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過(guò)1/10

建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無(wú)法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。

目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：

a.將第一鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。

b.使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行第一鏈反應(yīng)。

3.產(chǎn)生非特異性條帶

用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。

由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。

4. 產(chǎn)生彌散（smear）條帶

在PCR反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高

減少引物的用量

優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)

在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。

5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶

大多數(shù)情況下是由于退火溫度過(guò)低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的

對(duì)于長(zhǎng)片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）

6. 在無(wú)反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對(duì)照RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果

通常是由于對(duì)照RNA中含有痕量DNA而導(dǎo)致的。由于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。

有可能是引物二聚體的條帶

7. 擴(kuò)增產(chǎn)物滯留在加樣孔中

有可能是由于模板量過(guò)高而導(dǎo)致PCR結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。建議將第一鏈結(jié)果至少稀釋100倍再進(jìn)行二次擴(kuò)增。另外，在二次PCR時(shí)使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。

8. SSⅢ與SSⅡ有何不同？

具有更高的熱穩(wěn)定性（達(dá)50℃）

具有更長(zhǎng)的半衰期（達(dá)220分鐘）

對(duì)PCR無(wú)抑制

干冰運(yùn)輸

Tdt活性更低

9.為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript？

Thermo Script如果保存不當(dāng)會(huì)引起活性很快降低，SSⅢ則更穩(wěn)定。

10.為什么使用基因特異性引物（GSP）？

GSP在擴(kuò)增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時(shí)是最好的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄；隨機(jī)引物用于mRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄。

11.什么情況下需要使用RNase H？

在第一輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時(shí)

12.根據(jù)不同的目的選擇不同的系統(tǒng)：

目的建議：

RT與PCR使用不同的引物

或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶兩步法RT-PCR系統(tǒng)

高靈敏度一步法或兩步法RT-PCR系統(tǒng)

高特異性含有適當(dāng)?shù)?/span>DNA聚合酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)

或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)

高保真度含有Pfx Taq酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)

長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果通常使用兩步法RT-PCR系統(tǒng)可達(dá)到最佳結(jié)果

含Elongase酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)

二. Gene racer

1.如何針對(duì)Generacer試劑盒設(shè)計(jì)基因特異性引物（GSP）？

使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設(shè)計(jì)引物時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)要求：

50-70％的GC含量，以提高引物熔點(diǎn)（Tm）；

23-28個(gè)堿基長(zhǎng)度，以提高引物特異性；

降低3’端GC含量，將引物非特異性結(jié)合的可能性降至最低；

2.為什么得不到RACE產(chǎn)物？

加入Hela對(duì)照

低質(zhì)量的RNA模板

逆轉(zhuǎn)錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長(zhǎng)模板cDNA的合成

目的基因豐度太低，可以通過(guò)提高PCR的循環(huán)次數(shù)來(lái)解決，建議使用巢式PCR

目的基因沒(méi)有表達(dá)，可以通過(guò)使用兩條GSPs來(lái)分析cDNA中是否含有目的基因

目的基因太長(zhǎng)而不適合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建議使用Gene Racer試劑盒中的OligodT來(lái)得到全長(zhǎng)cDNA，使用隨機(jī)引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR。

cDNA模板屬于困難模板，可以通過(guò)以下方法解決：優(yōu)化PCR反應(yīng)參數(shù)及反應(yīng)體系；降低退火溫度；使用5-10％的DMSO幫助通過(guò)高GC含量區(qū)；使用高保真度和高延伸能力的酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。

3. RACE的PCR結(jié)果有雜帶

RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：

GSP與其他cDNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致在擴(kuò)增目的產(chǎn)物時(shí)得到無(wú)關(guān)產(chǎn)物。

Gene Racer引物和c-DNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一端帶有Gene Racer引物序列的PCR產(chǎn)物。

RNA降解。

PCR管或試劑污染。

注意：

雜帶一般是因?yàn)闆](méi)有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對(duì)照來(lái)確定。

4. 得不到全長(zhǎng)的5’RACE PCR產(chǎn)物

CIP反應(yīng)后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同Gene Racer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無(wú)降解。

CIP脫磷酸不完全，可以增加反應(yīng)中CIP的量或減少RNA的量。

PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。

三. PCR

在進(jìn)行PCR時(shí)：

請(qǐng)確保您沒(méi)有使用過(guò)量的起始DNA或者過(guò)高濃度的引物，也沒(méi)有加入過(guò)量的Mg2+

請(qǐng)確保您使用了恰當(dāng)?shù)耐嘶饻囟?/span>

請(qǐng)確保您沒(méi)有使用過(guò)量的DNA聚合酶

四.引物

1.應(yīng)該選擇哪種純化方法？

取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵锏拈L(zhǎng)度；

2.為什么我訂購(gòu)了50nmol，但是收到卻只有40nmol？

50nmol是起始量；

3.怎樣制備100μM的儲(chǔ)液？

體積（μL）=質(zhì)檢報(bào)告上的nmol數(shù)目×10；

4.怎樣設(shè)計(jì)引物？

一般長(zhǎng)度20～30bp；

至少50%的GC含量；

避免引物二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu)；

引物對(duì)的Tm值應(yīng)該接近。

5.引物序列有插入或缺失？

使用上游和下游引物多測(cè)幾個(gè)克隆。

請(qǐng)選擇正確的純化方法。

6. PCR無(wú)結(jié)果？

請(qǐng)檢查引物設(shè)計(jì)是否正確；

請(qǐng)檢測(cè)OD讀數(shù)是否正確；

做一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照

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