數(shù)字核酸擴(kuò)增和檢測(cè)方法可提供出色的靈敏度和特異性，并可以對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行絕對(duì)定量。在這些方法中，數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）通常用于DNA擴(kuò)增和絕對(duì)定量，其也是眾多數(shù)字化分析檢測(cè)方法的起源。dPCR由于其反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)且需要精細(xì)的溫度控制，因此對(duì)于POC應(yīng)用并不理想。等溫?cái)U(kuò)增（如LAMP）提供了一種快速，低成本的選擇，利用同樣的數(shù)字化思路，dLAMP的出現(xiàn)和發(fā)展逐漸得到人們的關(guān)注。本推送主要介紹dLAMP的主要技術(shù)原理。

1.什么是LAMP及其技術(shù)原理

之前的推送一直沒(méi)有好好解讀LAMP的技術(shù)原理。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是用于DNA擴(kuò)增的單管技術(shù)，與PCR相比，等溫?cái)U(kuò)增是在恒定溫度下進(jìn)行的，不需要熱循環(huán)儀，因此可大大減少儀器的復(fù)雜度，更便于開(kāi)發(fā)POCT儀器。該技術(shù)最早報(bào)道于2000年日本學(xué)者Notomi發(fā)表在Nucleic Acids Research的文章。一經(jīng)發(fā)布，就受到了世衛(wèi)組織WHO、各國(guó)學(xué)者和相關(guān)政府部門(mén)的關(guān)注，短短幾年，該技術(shù)已成功地應(yīng)用于SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測(cè)中。截止到目前為止，文章被引超過(guò)5500次。

從原理上講，LAMP使用兩套或三套引物和一種具有復(fù)制活性以及高鏈置換活性的聚合酶，可在60–65°C的恒定溫度下擴(kuò)增靶序列。通常，使用4種不同的引物來(lái)鑒定靶基因上的6個(gè)不同區(qū)域，從而大大提高了特異性。另外一對(duì)“環(huán)引物”可以進(jìn)一步加速反應(yīng)。由于這些引物作用的特殊性質(zhì)，在LAMP中產(chǎn)生的DNA量明顯高于基于PCR的擴(kuò)增。另一方面，引物的增加也使得LAMP引物設(shè)計(jì)變得更加困難，常常需要依賴(lài)第三方軟件和報(bào)道文獻(xiàn)進(jìn)行輔助設(shè)計(jì)。

LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)光度法進(jìn)行檢測(cè)，LAMP反應(yīng)溶液中作為擴(kuò)增副產(chǎn)物的焦磷酸鎂沉淀可以通過(guò)肉眼輕松觀察，特別是對(duì)于較大的反應(yīng)量，因此可用此開(kāi)發(fā)肉眼讀出的POC傳感器。同時(shí)，LAMP也可通過(guò)測(cè)量濁度或通過(guò)使用嵌入染料（例如SYTO 9）進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)跟蹤反應(yīng)。SYBR green等染料可以用于創(chuàng)建可見(jiàn)的顏色變化，而無(wú)需使用昂貴的設(shè)備即可用肉眼看到該顏色變化，或者可以通過(guò)儀器更準(zhǔn)確地測(cè)量出響應(yīng)。

LAMP的反應(yīng)體系一般包括4條引物、Bst DNA聚合酶緩沖液、具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、甜菜堿、Mg₂SO₄等。LAMP檢測(cè)體系中基因的擴(kuò)增和產(chǎn)物的檢測(cè)可一步完成，擴(kuò)增效率高，可在30~60 min擴(kuò)增10⁹~10¹⁰倍，特異性較高；同時(shí)反應(yīng)過(guò)程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg²⁺結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂。LAMP技術(shù)的主要原理是DNA在65 ℃左右可以處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，DNA在此溫度下利用4條特異性引物依靠一種鏈置換DNA聚合酶，使鏈置換DNA的合成不停地自我循環(huán)。

2.什么是Digital LAMP

和Digital PCR類(lèi)似，最早報(bào)道Digital LAMP也是利用物理腔室進(jìn)行反應(yīng)分隔，只不過(guò)Digital LAMP直接使用了當(dāng)時(shí)成熟的微流控芯片。文章的作者有加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的Luke P. Lee教授和Daniel T. Chiu教授，其都是該領(lǐng)域的絕對(duì)大咖。

數(shù)字化的本質(zhì)是對(duì)LAMP反應(yīng)體系的分割化，使得每個(gè)微小的反應(yīng)腔室的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。經(jīng)過(guò)擴(kuò)增之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒(méi)有模板的反應(yīng)器就沒(méi)有熒光信號(hào)，通過(guò)計(jì)算熒光信號(hào)的比例和泊松公式計(jì)算出核酸分子的絕對(duì)數(shù)量。

文章另一個(gè)特點(diǎn)是使用一種叫做自數(shù)字化的微流控技術(shù)（self-digitization chip），這種技術(shù)常見(jiàn)于細(xì)胞捕獲（如循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲和分析）和化學(xué)合成中。根據(jù)文章報(bào)道，Digital LAMP能夠在70分鐘內(nèi)完成整個(gè)檢測(cè)，最低可檢測(cè)20個(gè)拷貝的噬菌體DNA。

        之后的研究報(bào)道更多采用液滴微流控技術(shù)進(jìn)行Digital LAMP，檢測(cè)靈敏度也達(dá)到了幾個(gè)拷貝。于此同時(shí)，Digital LAMP在細(xì)菌、病毒檢測(cè)上也逐步展開(kāi)，甚至逐步拓展到其它體外診斷領(lǐng)域。其中最為出名的是Rustem F. Ismagilov教授發(fā)到Science Translational medicine上的一篇文章，其使用Digital LAMP在30分鐘內(nèi)完成了常規(guī)方法需要幾天的抗體敏感性實(shí)驗(yàn)AST。

3.數(shù)字化核酸擴(kuò)增的特點(diǎn)和平臺(tái)

準(zhǔn)確度高

通過(guò)樣本的離散化，極微量的變異分子與正常分子被區(qū)分開(kāi)來(lái)，使得稀有突變基因被單獨(dú)檢測(cè)，再通過(guò)陽(yáng)性信號(hào)單元所占的數(shù)量和比例來(lái)精準(zhǔn)地計(jì)算突變率或突變量。

靈敏度高

具有對(duì)低拷貝核酸分子數(shù)的區(qū)分能力，這是LAMP難以達(dá)到的。

絕對(duì)定量

以陽(yáng)性信號(hào)和陰性信號(hào)微單元的數(shù)量及比例來(lái)確定原始樣本中目標(biāo)核酸分子數(shù)，不需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可進(jìn)行精確定量。

不易受抑制劑的影響

通過(guò)分散到各個(gè)反應(yīng)微單元，能夠有效降低了抑制劑對(duì)擴(kuò)增的影響。

如今，商業(yè)化的dPCR平臺(tái)不斷面世，主要有Fluidigm公司的Bio-MarkTM高通量基因分析系統(tǒng)、Bio-rad公司的QX100和QX200微滴式dPCR系統(tǒng)、ThermoFisher公司的QuantStudioTM3DdPCR系統(tǒng)、RainDanceTechnologies公司的RainDropTMdPCR系統(tǒng)和Formulataix公司的ConstellationTMdPCR系統(tǒng)等。為了對(duì)比Digital LAMP與其它方法在檢測(cè)性能上的區(qū)別，研究者通過(guò)使用Bio-rad公司的微滴式dPCR系統(tǒng)和Fluidigm的Biomark 12.765 Digital Array平臺(tái)檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒，結(jié)果顯示dLAMP具有更好的抑制劑抵抗力。

4.總結(jié)

數(shù)字化核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高辨識(shí)力、高耐受性、可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量分析的核酸分子診斷技術(shù)，是現(xiàn)有核酸診斷技術(shù)的補(bǔ)充，其所具備的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)必將大大推動(dòng)生物學(xué)研究、臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的發(fā)展。同時(shí)，它也預(yù)示著一個(gè)擁有巨大潛能的新興產(chǎn)業(yè)和技術(shù)。dLAMP相對(duì)于dPCR速度更快，成本也更低，在dPCR難以實(shí)現(xiàn)POCT的情況下，不失為一個(gè)新的選擇。目前的數(shù)字化核酸擴(kuò)增技術(shù)仍處于待完善階段，還存在許多不足之處。比較經(jīng)典的Bio-rad液滴式dPCR系統(tǒng)由液滴發(fā)生器、PCR擴(kuò)增儀和液滴信號(hào)讀取器3種設(shè)備配套組成，集成度差，儀器成本高，一般的實(shí)驗(yàn)室難以承受。數(shù)字化核酸擴(kuò)增技術(shù)的通量增高或者微單元體積縮小時(shí)，現(xiàn)有信號(hào)采集的方法難以做到簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，常需要后期繁瑣的信號(hào)處理與分析過(guò)程。但是，隨機(jī)技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信這些技術(shù)會(huì)逐步出現(xiàn)在體外診斷的各種產(chǎn)品中。

免責(zé)聲明：文章來(lái)源《 小桔燈網(wǎng)》微信公眾號(hào) 作者： 石頭道科普 以傳播知識(shí)、有益學(xué)習(xí)和研究為宗旨。 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除。