作為一切分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，核酸的提取永遠(yuǎn)是開展一項(xiàng)研究的第一步，提取核酸的質(zhì)量高低是下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。本文將會(huì)詳細(xì)介紹關(guān)于DNA提取的相關(guān)信息，包括DNA提取的原理、提取過程的注意事項(xiàng)、不同類型樣品DNA的提取推薦方法等等。

DNA提取的基本原理

DNA的提取可以簡(jiǎn)單的分為裂解和純化兩大步驟，裂解是破壞樣品細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而使樣品中的DNA游離在裂解體系中的過程，純化則是使DNA與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。

裂解過程

常規(guī)的裂解液都含有去污劑 (如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20等) 和鹽 (如Tris、EDTA、NaCl等)。

· 去污劑的作用

· 使蛋白質(zhì)變性；

· 破壞膜結(jié)構(gòu)；

· 去除與核酸相互作用的蛋白質(zhì)。

· 鹽的作用

· 提供合適的裂解環(huán)境，如Tris;

· 抑制核酸酶對(duì)核酸的降解，如EDTA；

· 維持核酸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，如NaCl。

裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)DNA與蛋白質(zhì)的分離，同時(shí)，也便于后續(xù)的純化操作。

純化過程

酚氯仿抽提

該方法包括兩個(gè)步驟：

00001. 利用酚氯仿對(duì)裂解體系進(jìn)行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)DNA與蛋白質(zhì)的分離；

00002. 再用醇將DNA沉淀下來，實(shí)現(xiàn)核酸與鹽的分離。

酚氯仿抽提是去除蛋白質(zhì)的有效手段，但如果蛋白質(zhì)含量超過了其飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)就不會(huì)被一次性去除，需要進(jìn)行多次反復(fù)抽提，而每次的抽提均會(huì)導(dǎo)致核酸的損失。

酚氯仿抽提最大的優(yōu)勢(shì)是成本低廉，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較低。

高鹽沉淀法

高鹽沉淀法是酚氯仿抽提方法的一個(gè)變種，其省略了酚氯仿抽提操作的麻煩，并且幾乎克服了酚氯仿抽提方法的一切缺點(diǎn)，只是得到DNA的純度不夠穩(wěn)定。

離心柱純化

該方法利用某些固相介質(zhì)，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸而不吸附蛋白質(zhì)及鹽的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離，是目前試劑盒提取廣泛使用的方法。

該方法受人為操作因素影響小，提取DNA的純度穩(wěn)定性很高，其缺點(diǎn)是當(dāng)樣品過量時(shí)，需要反復(fù)進(jìn)行離心，對(duì)樣品的提取效率較低。

磁珠法

該方法將純化介質(zhì)包被在納米級(jí)的磁珠表面，通過介質(zhì)對(duì)DNA的吸附，在外加磁場(chǎng)的作用下使DNA附著于磁珠并定向移動(dòng)，從而達(dá)到核酸與其它物質(zhì)分離的目的。

與其它集中方法相比，磁珠法具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)，包括：

· 提取靈敏度高 (只需微量的樣本)；

· 純化的純度高 (能夠使核酸完全與雜質(zhì)分離)；

· 提取產(chǎn)量高 (每mg磁珠能吸附500μg DNA)；

· 分離速度快 (磁場(chǎng)分離只需幾秒鐘)；

· 自動(dòng)化操作 (通過機(jī)器自動(dòng)完成操作過程，無需人力)；

· 高通量提取 (可同時(shí)完成數(shù)百個(gè)樣品的提取)；

· 無毒無害無污染 (試劑中不含任何有毒物質(zhì))。

該方法依賴于磁力分離裝置或自動(dòng)提取儀，目前價(jià)格依然很高，并不適用于小型實(shí)驗(yàn)室常規(guī)實(shí)驗(yàn)。

DNA提取的注意事項(xiàng)

樣品的采集和保存

樣品的采集和保存是DNA提取的第一步，合適的樣品采集和保存方法對(duì)于DNA提取的成敗至關(guān)重要，尤其是有些珍貴樣品，其采集和保存的方式更是需要特別關(guān)注。

動(dòng)植物樣品的采集

· 動(dòng)物的內(nèi)臟和皮膚樣品要在動(dòng)物死亡后2h以內(nèi)采集，通常采集多個(gè)重復(fù)，切成小塊保存在消毒后的離心管中；

· 動(dòng)物呼吸道樣品通過棉拭子進(jìn)行蘸取，完成采樣后立即置于5mL磷酸鹽緩沖液中；

· 動(dòng)物血液樣品采集后，立即加入抗凝劑，封口病豎立插入樣品盒，盡量不要使用肝素抗凝；

· 植物樣品采集時(shí)優(yōu)先選取核酸含量較多的部位，如植物的幼嫩部位；

· 采集植物樣品時(shí)建議使用無菌水或75%乙醇擦拭或沖洗干凈，再用吸水紙吸干樣品表面液體。

微生物相關(guān)樣品采集

針對(duì)微生物研究相關(guān)的樣品，首先要避免人源污染，采樣的器具都應(yīng)經(jīng)過高溫滅菌，采樣過程中要戴手套。

其次要關(guān)注樣品運(yùn)輸和處理的速度，很多環(huán)境微生物研究的樣品并非來自實(shí)驗(yàn)室，而是來源于自然環(huán)境，有些樣品的采集位點(diǎn)甚至在人跡罕至的地區(qū)，這就涉及到樣品的運(yùn)輸問題。最理想的樣品運(yùn)輸條件是在液氮中冷凍運(yùn)輸，如沒有條件也可將樣品裝入含有冰袋的泡沫箱中運(yùn)輸，如樣品運(yùn)輸距離較遠(yuǎn)、時(shí)間較長(zhǎng)，最好選擇專業(yè)的冷鏈運(yùn)輸公司。

針對(duì)水體樣品微生物群落的研究，需要用抽濾的方式將樣品中的微生物濃縮至濾膜上，之后再提取其DNA，通常情況下普遍認(rèn)為采用0.22μm孔徑的濾膜進(jìn)行抽濾能夠收集到水體樣品中的完整微生物群落。

有時(shí)我們會(huì)首先使用0.8μm孔徑的濾膜對(duì)水體樣品進(jìn)行預(yù)處理，以去除大的顆粒物質(zhì)，之后再用0.22μm濾膜收集微生物，這時(shí)會(huì)遇到一個(gè)問題，就是去除的顆粒物質(zhì)也會(huì)吸附一部分微生物，因此造成了最終收集的微生物樣品不完整，本人之前的一篇文章就被審稿問了這個(gè)問題，所以在進(jìn)行樣品處理的時(shí)候，一定要首先明確要研究的是被顆粒物吸附的微生物、還是游離態(tài)的微生物、或者是完整的微生物群落，以確定最適合的抽濾方案。

樣品的保存

絕大部分情況下，使用新鮮樣品可以獲得最好的結(jié)果。如果組織樣品不能馬上進(jìn)行DNA提取，短期內(nèi)可以冷凍于-20℃，稍長(zhǎng)時(shí)間的保存可以采用無水乙醇進(jìn)行固定。

此外還推薦另外一個(gè)可以長(zhǎng)期保存的方法 (適用于有錢人)，可以使用QIAGEN公司的RNAlater進(jìn)行組織樣品的保存，這個(gè)試劑不僅可以保存RNA，同時(shí)也能夠防止DNA的降解，本人之前有過保存了一年左右的樣品，DNA提取的效果同樣很好。

DNA提取方法的選擇

開展針對(duì)某個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的DNA提取之前，一定要先行收集該樣品的特性信息，例如該樣品的核酸含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量等，否則就會(huì)造成DNA提取失敗，從而無法開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。只有對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品有所了解，才能正確選擇DNA提取方法。

含蛋白酶的裂解方法，可以認(rèn)為是抽提基因組 DNA 的首選。蛋白酶的作用是分解蛋白質(zhì)，從而使蛋白質(zhì)變小，促進(jìn)蛋白質(zhì)的游離，基因組DNA是很容易“纏”住其它生物大分子物質(zhì)，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，不容易被基因組DNA“纏”住，有利于蛋白質(zhì)在純化過程中被去除，使最終獲得的基因組DNA的純度更高。

含CTAB的裂解液，是針對(duì)富含多糖樣品 (如細(xì)菌、植物等) 基因組DNA抽提的首選裂解方法。CTAB的質(zhì)量對(duì)裂解效率有很大的影響，盡量使用高純度的CTAB，并且不要輕易更換生產(chǎn)廠家。CTAB的少量殘留也會(huì)對(duì)酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時(shí)的溫度，一般使用65℃，但如果發(fā)現(xiàn)DNA降解嚴(yán)重或者得率太低，可以嘗試在37～45℃進(jìn)行裂解。

當(dāng)對(duì)大量純培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行PCR鑒定時(shí)，可以直接使用未裂解的菌體當(dāng)作模版進(jìn)行PCR，只需延長(zhǎng)PCR預(yù)變性的時(shí)間，即可在該階段完成菌體的裂解并釋放DNA。但是該方法由于沒有經(jīng)過純化的過程，因此可能出現(xiàn)一定的假陽性，該方法最適合從大量菌株樣本中篩選含有特定基因的目的菌株，但是并不適合判斷某一特定菌株是否含有目的核酸片段。

DNA的保存

提取得到的DNA通常使用TE buffer進(jìn)行最后的溶解，其含有的EDTA可以減少DNA被可能殘留的DNase降解的風(fēng)險(xiǎn)，但是如果提取方法合適、操作得當(dāng)，則幾乎不會(huì)殘留DNase，使用無菌水溶解DNA也是可以的。

提取到的DNA一般情況下在-20℃保存是沒有問題的，但是要避免反復(fù)凍融，因此，最好在提取完成之后按照后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需進(jìn)行分裝，這樣每次使用一個(gè)分裝好的DNA，避免反復(fù)凍融造成的DNA降解。如果提取的DNA需要長(zhǎng)期保存 (一年以上)，最好保存于-80℃。

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