早在1992 年，已有學者提出了數(shù)字聚合酶鏈式反應( Digital PCR，dPCR)的概念，并且指出其在DNA的定量分析方面具有顯著優(yōu)勢。但是初期的dPCR技術發(fā)展十分緩慢，這是由于如果使用傳統(tǒng)的96孔板或者384孔板進行PCR擴增，需要數(shù)個多孔板同時進行擴增，不僅操作復雜，且實驗樣品和試劑的消耗量非常大。在當時的條件下，研究者很難開展數(shù)字PCR的研究。此外，在DNA 定量研究方面，由于實時熒光定量PCR( Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)等技術的發(fā)展和廣泛應用，也使得dPCR技術的發(fā)展緩慢。

隨著微流控技術的出現(xiàn)和近年來的高速發(fā)展，研究者嘗試將微流控技術與數(shù)字PCR技術結合起來。與微流控芯片結合后的dPCR技術的靈敏度和精確度有了很大提高，在單細胞研究、基因測序、醫(yī)學診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等領域得到了越來越多的應用，展現(xiàn)出了廣泛的應用潛力。近年來，還涌現(xiàn)出一批商業(yè)化的dPCR檢測設備。本文將詳細介紹近年來dPCR技術及液滴微流控芯片的發(fā)展狀況，并介紹了dPCR技術在醫(yī)學、生命科學等領域的實際應用情況。

1.dPCR 原理

傳統(tǒng)的實時定量PCR以指數(shù)形式體現(xiàn)定量信息，而dPCR技術所能提供的DNA 量化信息是以線性的數(shù)字化形式體現(xiàn)的。dPCR的原理如圖1所示，將含有目標基因、引物、聚合酶等的溶液稀釋后，根據(jù)實驗需要被分成10^2～10^7份不等的溶液(反應單元)，每份溶液中至多只含有一個目的基因拷貝。這些溶液單元經(jīng)過與傳統(tǒng)的PCR技術相同的熱循環(huán)擴增后，對每份溶液進行檢測。如果含有目的基因，則計為“1”(陽性反應) ；不含有目的基因，則計為“0”(陰性反應) ，這些代表陽性反應的數(shù)字“1”和代表陰性反應的數(shù)字“0”類似于數(shù)字電路中的通和斷兩種狀態(tài)，這也是dPCR名稱的由來。最后通過對陽性反應的單元計數(shù)可以獲知擴增之前目的基因的絕對數(shù)量?？紤]到有可能出現(xiàn)擴增前一個反應單元里有兩個或以上目的基因的情況，使用泊松分布進行校正可以進一步增加對擴增前目的基因計量的準確度。

圖1 dPCR 技術原理示意圖

與傳統(tǒng)的PCR技術相比，由于熱循環(huán)和熒光探針標記等技術已經(jīng)較為成熟，dPCR主要的技術難點體現(xiàn)在對稀釋后的反應溶液進行大規(guī)模等分的技術上。在對稀釋后的溶液進行等分方面，最初采用了96 孔或384 孔板的方法，但這種方法試劑消耗量巨大(每孔約5μL)，且可實現(xiàn)的反應單元數(shù)量較少。后來盡管在反應單元的數(shù)量上有所增加，如Shen等在玻璃基底加工了1280個反應單元，但仍存在溶液等分不能自動完成和反應單元數(shù)量較少的問題。直到微流控技術被應用到dPCR領域后，反應單元的數(shù)量才得到了爆發(fā)式的增長。關于微流控技術在dPCR領域的應用，本文后續(xù)部分會詳細介紹。

為了進一步說明dPCR技術的原理，圖2 顯示了dPCR技術在胎兒早期疾病診斷中的應用。圖2a是檢測過程中一組12塊多孔板中的1塊，具有765個反應單元，每個反應單元的容積為6 nL，含有目標基因、引物、熒光探針等的反應溶液通過微流控技術被均勻送入各個反應單元中。經(jīng)過PCR擴增后，由TaqMan 探針標記的含有目標基因的反應單元發(fā)出熒光，可以很容易地觀察到。經(jīng)過計算機圖像處理，轉(zhuǎn)換為圖2b所示的熱點圖(Heat map) ，每個紅點代表一個含有目標基因的反應單元，通過熱點圖就可以準確分析出目標基因的數(shù)量。圖2c是作為參考的dPCR的擴增曲線，需要指出的是，dPCR對目標基因的測量并不需要擴增曲線的幫助，而在實時熒光定量PCR檢測中，對目標基因擴增數(shù)量的檢測直接依賴于與標準曲線的對比，由于標準曲線與實際樣品擴增效率不同等原因，導致熒光實時定量PCR檢測的準確度偏低。Hindson和Whale等對實時熒光PCR技術和dPCR技術進行了系統(tǒng)對比，結果表明，相比于實時熒光定量PCR，dPCR對目標基因定量檢測的靈敏度、精度、檢測時間等方面有著非常顯著的優(yōu)勢。在檢測精度方面，dPCR與實時熒光PCR相比，相對標準偏差(RSD) 顯著減小，測量精密度提高；在檢測時間方面，如果保持與熒光PCR相同的精度，dPCR的日檢測量增加了7倍。

圖2 采用dPCR技術在微流控陣列中對采自孕婦血漿中的胎兒DNA 進行擴增   

(a) 同一個芯片陣列在擴增前后的對比(b) 陽性反應的熱點圖(c) 擴增過程的指數(shù)圖

早期的微流控技術與dPCR的結合應用體現(xiàn)在以集成流路微流控芯片(Integrated fluid circuit，IFC)為基礎的dPCR技術。這種微流控芯片采用多層光刻技術加工而成，具有非常復雜的流路結構以及氣動的微泵與微閥，通過微泵和微閥將溶液送入反應腔陣列，其加工過程復雜，成本非常高，且受到加工技術和成本的限制，IFC芯片可以實現(xiàn)的反應單元數(shù)量一般不超過10000個。

近年來，液滴微流控技術的發(fā)展給dPCR帶來了新的發(fā)展機遇。采用液滴微流控技術，經(jīng)過高度稀釋的含有模板DNA 和引物等的反應溶液可以在微流控芯片中很容易地被分成10^2～10^7小液滴，每個體積只有納升甚至皮升的小液滴都是只含有最多一個目的基因的微型反應器，經(jīng)過PCR擴增后，通過熒光檢測，可以很直觀地定量分析出原始溶液中目的基因的拷貝數(shù)量。

與IFC 芯片相比，液滴微流控芯片的優(yōu)勢不止體現(xiàn)在反應單元的數(shù)量，其最大優(yōu)勢在于成本方面：IFC 芯片的加工采用接近納米尺度的多層光刻技術，成本非常高；而液滴微流控芯片大多只有一層結構，且加工尺度在微米級，因此大大降低了芯片的加工成本(微流控芯片的加工成本占芯片總成本的大部分)，這對于dPCR技術的發(fā)展至關重要。

2.液滴微流控技術

2.1微流控系統(tǒng)中微液滴的產(chǎn)生方法

如前所述，微流控技術對于dPCR發(fā)展的貢獻主要在于可以大規(guī)模增加反應單元的數(shù)量，通過微流控技術，高效精確地將樣本溶液分割為10^2～10^7份。微流控技術對樣本溶液的分割，最初是由氣動微泵、微閥控制分割樣本溶液的IFC 芯片，不僅結構較為復雜，加工難度也較大，可以分割的份數(shù)也非常有限，單塊芯片的成本非常高。近年來，研究者開始使用微流控系統(tǒng)產(chǎn)生大量微液滴的辦法實現(xiàn)對樣本溶液的分割，每個產(chǎn)生的含有目的基因、探針和引物等的微液滴都可以作為一個獨立的反應單元進行PCR擴增，而微滴產(chǎn)生的速度、數(shù)量、體積等均可以通過微流控系統(tǒng)精確控制。相比于IFC芯片，液滴微流控芯片的加工過程簡單，成本低廉，代表了未來微流控與dPCR結合的發(fā)展方向。下面將結合微液滴在dPCR領域的應用，簡要介紹使用微流控系統(tǒng)產(chǎn)生及操控微液滴的技術。

通過微流控系統(tǒng)產(chǎn)生大量應用于dPCR技術的微液滴，最常用的方法是乳化技術( Emulsion) ，即兩種不相溶的液體混合時，一種液體會以微滴的形式分散在另一種溶液中。微流控芯片可以在微尺度上對一種溶液(分散相) 在另外一種不相溶的溶液(連續(xù)相) 中產(chǎn)生微液滴的過程進行精確控制，繼而獲得大量體積在納升甚至皮升級，且大小均一的微液滴。

圖3顯示了使用液滴dPCR技術對癌癥基因進行篩選和測序的應用研究。如圖3所示，在一個T形( T-junction) 的微通道中，黃色代表油，藍色代表包含引物、熒光探針以及目標基因等的水溶液。由于兩種液體不相溶，在微通道的液體流動過程中，油在微通道內(nèi)在向左側流動的過程中對水溶液不斷進行擠壓，作為分散相的水溶液在連續(xù)相油的不斷擠壓中被最終剪斷，形成了一個微液滴(本例中體積為2.5 nL)。分散后的微液滴含有至多一個目的基因以及引物、熒光探針等，分散后的液滴可以使用傳統(tǒng)的PCR技術進行擴增，由于油的阻隔，在擴增過程中，每個微液滴都是一個相對獨立的反應單位。

圖3 用于單分子PCR研究的微液滴產(chǎn)生過程

除了圖3所展示的T 形微通道的液滴產(chǎn)生系統(tǒng)，類似的還有Y形、十字形等多種微通道結構，都可以用于產(chǎn)生微液滴。除了乳化法之外，還可以采用流動聚焦(Flow-focusing)等方法產(chǎn)生單/雙/多層包裹的微液滴(Single /double /multiple emulsion)。采用微流控技術產(chǎn)生微液滴的大小與微通道的尺寸及連續(xù)相和分散相的流速、粘度等都有直接關系?，F(xiàn)階段使用微流控技術可以產(chǎn)生的微液滴的體積范圍從0.05 pL到1 nL不等，對應的微液滴直徑為5～120 μm，實際應用中可以靈活選擇。文獻中采用的是以油包水(W/O) 方式產(chǎn)生的微液滴，根據(jù)實驗需要，同樣的微流控系統(tǒng)還可以產(chǎn)生水包油(O/W) 的微液滴，甚至氣體包水(W/G) 的微液滴。

在連續(xù)相液體的選擇方面，多采用礦物油( Mineral oil) ，對微液滴形狀的保持和微液滴間的阻隔起到了重要作用，且對微液滴中參與PCR擴增的生物大分子、酶等的活性和結構沒有影響。為了增強液滴產(chǎn)生的穩(wěn)定性和控制分散相微液滴的大小，有的研究者在礦物油中加入了0.5% ～ 3.0%的表面活性劑。在水或油中添加表面活性劑對微液滴的穩(wěn)定起到了重要作用，且未發(fā)現(xiàn)毒副作用。未來的研究中，可以通過改變微通道表面的物理化學性質(zhì)等方法(物理/化學修飾) ，增加微流控系統(tǒng)產(chǎn)生微液滴的穩(wěn)定性，從而擺脫對價格昂貴的表面活性劑的依賴，減少對溶液的污染。

微流控芯片材料的選擇與其應用環(huán)境有直接關系。目前，在dPCR領域，無論是IFC 芯片，還是液滴微流控芯片，通常使用聚二甲基硅氧烷(PDMS) 材質(zhì)的微流控芯片。PDMS 具有良好的生物相容性和透氣性，且微加工性能良好，但在某些有機溶劑的作用下會發(fā)生溶解和變形。根據(jù)目前微流控技術發(fā)展的總體趨勢，未來非常有可能產(chǎn)生基于熱塑性塑料(如： PMMA、PS、PC 等) ，甚至紙基等低成本微流控dPCR芯片。

2.2 微液滴的高通量生成技術

液滴微流控芯片在dPCR領域的應用是利用了液滴微流控系統(tǒng)可以迅速產(chǎn)生大量的微液滴的優(yōu)勢。近年來，在產(chǎn)生高通量微液滴的微流控芯片方面進行了大量研究，目前，單一微液滴產(chǎn)生裝置的液滴產(chǎn)生速度可以高達10 kHz，如果將多塊微流控芯片并行使用，或者在一塊微流控芯片上加工數(shù)十到數(shù)百個微液滴產(chǎn)生裝置，還可以極大提升液滴的產(chǎn)生速度。Nisisako 等在一塊圓形的玻璃基底上呈輻射狀排布了128 個Y 形微液滴產(chǎn)生器，每小時可產(chǎn)生1 L 粒徑為96.4 μm的微液滴。

圖4 展示了Holtze等制作的高速微液滴發(fā)生微流控芯片，芯片采用了軟光刻的方法，使用傳統(tǒng)紫外光刻技術對SU-8進行曝光沖洗后，利用SU-8作為模具，對PDMS 進行倒模，最后將PDMS 鍵合在玻璃片上制成微流控芯片。他們不僅在連續(xù)相的油中添加了表面活性劑，還在分散相的水中也添加了具有良好生物相容性的表面活性劑( PFPE-PEG共聚物) ，從而極大提高了微液滴高速產(chǎn)生時的穩(wěn)定性，液滴的產(chǎn)生速度可以達到30 kHz(圖4a) 。從圖4b 可見，隨著微通道內(nèi)油流量上升，微液滴的產(chǎn)生速度也迅速上升，產(chǎn)生的微液滴的直徑隨之變小。為了驗證PFPE-PEG共聚物作為表面活性劑的生物兼容性，在微液滴中進行了質(zhì)粒DNA 體外編譯β-Galactosidase 酶的實驗，獲得了滿意的效果。

圖4 液滴產(chǎn)生過程中的穩(wěn)定性 

(a) 使用流動聚焦的方法從25 μm的噴嘴中產(chǎn)生的微液滴，(b) 在水流速不變的情況下，微液滴產(chǎn)生的頻率和大小與油流速之間的關系

值得注意的是，高通量的微液滴產(chǎn)生技術對微流控芯片系統(tǒng)以及擴增后的液滴熒光檢測都提出了更高的要求。首先，產(chǎn)生高通量液滴的微流控芯片對反應液體進樣的穩(wěn)定性和連續(xù)性都提出了更高要求，這種情況下，反應液體進樣常需要通過價格高昂的恒壓泵實現(xiàn)。其次，高通量的液滴產(chǎn)生微流控系統(tǒng)對芯片的鍵合也提出了更高要求，內(nèi)部的高壓液體對芯片的鍵合強度要求更高。最后，對液滴的熒光檢測的速度方面也提出了更高要求，檢測系統(tǒng)不僅需要在極短時間內(nèi)對微流控芯片中按順序排布流動的微液滴進行熒光檢測，還需要高速的數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計能力。

3.dPCR 與液滴微流控芯片的結合和應用

目前，基于液滴微流控芯片的dPCR( Droplet digital PCR，ddPCR) 已被廣泛應用于疾病檢測、基因診斷、基因測序、食品安全等多個領域。

在疾病檢測和基因診斷方面，Heredia 等采用液滴dPCR技術對乳腺癌腫瘤細胞中的表皮生長因子受體( HER2) 的表達水平進行了研究。與之前研究者的結果相比，采用dPCR顯著提高了對HER2 表達水平的準確度，為研究HER2 表達水平與乳腺癌發(fā)病之間的關系提供了準確數(shù)據(jù)。dPCR技術在疾病診斷領域的應用遠不止于乳腺癌領域，在肺癌、結腸癌等疾病的檢測領域，研究者也利用dPCR技術對其相應的標志物(如：EGFR、KRAS等)進行了檢測，從而實現(xiàn)了在基因水平上對疾病診斷的目的。利用dPCR技術的高靈敏度，還可以對微量的游離在血液中的腫瘤導致的CNAs 進行檢測，對于癌癥的早期診斷有著重要的意義。實驗表明，利用dPCR技術，可以達到在10^6個野生型中檢測出一個突變基因的靈敏度。Contente-Cuomo等使用液滴dPCR對微量的游離在細胞外可作為癌癥標志物的DNA片段進行了檢測，驗證了在血液的復雜背景中，利用dPCR技術對循環(huán)腫瘤標志物檢測的可行性。

在環(huán)境工程和食品安全領域，Bian等采用經(jīng)過油飽和處理的基于PDMS 材料的微流控芯片，對飲用水中E.coliO157和L.monocytogenes 兩種細菌進行了dPCR檢測(圖5) ，分別用兩種不同顏色的熒光探針標記兩種細菌，PCR擴增后可以同時對兩種顏色熒光微液滴進行檢測計數(shù)，從而得到兩種細菌在初始溶液中的絕對定量結果，用這種方法對飲用水的檢測精度可以達到10 CFU/mL。在食品安全領域，為了適應歐盟對轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的嚴格要求，Dobnik等提出并驗證了利用液滴dPCR技術對歐盟境內(nèi)種植的12種轉(zhuǎn)基因玉米進行快速檢測的方法。Dany 等也使用dPCR—實時熒光PCR聯(lián)用技術對食品、飼料、種子中的轉(zhuǎn)基因成分進行了測定，在提高精度的同時也降低了檢測成本。

圖5 使用液滴dPCＲ 對E.coliO157 和L.monocytogenes 同時進行檢測
(a) 微流控芯片的加工(b) 產(chǎn)生微液滴(c) 在微流控芯片上進行擴增和使用通過熒光分析結果

在液滴微流控技術與dPCR的結合應用方面也有一些商業(yè)化產(chǎn)品，如Bio-Rad 公司的QX 系列液滴dPCR檢測系統(tǒng)，其中QX100系統(tǒng)中的液滴微流控芯片可以在一次分析中將樣品溶液分成11.2 萬～12.8 萬個小液滴，每塊芯片的價格僅為24美元。在QX100 系統(tǒng)中，使用了前文提到過的十字形的微流道，分散相溶液在連續(xù)相油的擠壓中不斷產(chǎn)生小液滴，通過數(shù)個液滴產(chǎn)生微流控芯片的并行協(xié)作，在短時間內(nèi)產(chǎn)生了大量的小液滴，每個小液滴就是一個反應容器； PCR熱循環(huán)擴增結束后，又使用微流控技術，使小液滴依次通過檢測裝置對其進行熒光檢測，完成計數(shù)過程。與之相似，RainDance 公司的Rraindrop系統(tǒng)附帶的微流控芯片的8 個進樣通道同時工作時，最高可將樣品溶液分為8000萬個pL 級的微液滴，每塊微流控芯片的成本也只有80～240 美元。相比之下，F(xiàn)luidigm公司BioMark系統(tǒng)使用的基于IFC技術的微流控芯片中的12個反應單元陣列加起來也僅有9180個反應單元，每塊芯片價格卻高達400 美元。由此可見，從單個芯片的價格和對反應溶液分割的份數(shù)來看，液滴微流控芯片相比于IFC芯片都擁有巨大的優(yōu)勢。

典型的商業(yè)化液滴dPCR系統(tǒng)的工作原理如圖6所示，含有目的基因、Taq 聚合酶、引物、分子信標(如：TaqMan等) 的溶液經(jīng)過微流控芯片，被分為數(shù)百萬個微液滴，分散的微液滴被收集在離心管中進行PCR熱循環(huán)擴增，擴增的同時，通過熒光探針/分子信標標記目的基因，最后，微液滴被重新送入微流控芯片中，微液滴依次通過熒光傳感器進行檢測，最后得到數(shù)據(jù)分析圖。值得一提的是，現(xiàn)階段微液滴一般可以通過熒光探針標記兩種顏色，如果對熒光探針的強度進行控制，基于兩種顏色的探針最多可以達到12 個標記的多重分析。

圖6  基于液滴微流控技術的dPCR工作流程

4.結語和展望

與傳統(tǒng)的依靠標準曲線和循環(huán)閾值進行定量檢測的實時熒光PCR技術相比，在目標基因的定量精度和靈敏度方面，dPCR具有非常明顯優(yōu)勢：通過對溶液的高度稀釋和分割，每份溶液中都至多含有一個目標基因，在擴增后，通過熒光檢測，可以準確定量分析出原始溶液中的目標基因數(shù)量。

dPCR技術在基因工程、疾病檢測以及環(huán)境工程等領域得到了較為廣泛的應用，無疑是未來PCR技術的發(fā)展方向。液滴dPCR是近年來興起的一項新dPCR技術，是微流控技術與dPCR結合產(chǎn)生的新成果。相比于基于IFC 的dPCR芯片，液滴dPCR對反應溶液的分割數(shù)量增加了上千倍，可以容易地將反應溶液分割為數(shù)百萬份含有至多一個目標基因的微液滴，大大提高了定量分析精密度，不僅推動了dPCR在更多領域的應用，且顯著降低了dPCR技術的成本。

目前，包括液滴dPCR在內(nèi)的整個dPCR技術還處于發(fā)展初期，與液滴dPCR相關的液滴微流控芯片技術、多重熒光探針、反應后微液滴的高速檢測等相比還有很大發(fā)展的空間。在液滴微流控芯片技術方面，其技術難點在于大規(guī)模高通量的液滴產(chǎn)生技術，高通量往往是通過增加芯片中的液體流動速度和采用數(shù)塊微流控芯片并行運作實現(xiàn)的，這對芯片的設計、微通道的加工、芯片的鍵合等都提出了更高的要求，是未來技術攻關的重要難點之一。在多重熒光探針的使用方面，多數(shù)實驗室研究和商業(yè)化產(chǎn)品使用的都是1～2個熒光探針，可以實現(xiàn)對1～2個目標基因的同時檢測。在未來的dPCR技術發(fā)展中，提高熒光探針數(shù)量必然是發(fā)展趨勢之一，在一次dPCR檢測中對多個目標基因進行定量分析，大大提高效率，降低成本，對醫(yī)學檢測等領域的應用有著重要意義。前面提到的高通量液滴產(chǎn)生技術和多重熒光探針技術也都對PCR擴增后的熒光檢測系統(tǒng)提出了更高的要求，在非常短的時間內(nèi)，不僅需要熒光檢測系統(tǒng)對液滴是否具有熒光做出判定，還需要對熒光的顏色做出準確判斷，所以，未來dPCR技術發(fā)展中高速熒光檢測和信號處理也是亟待解決的難題。

此外，值得重點關注的是液滴dPCR技術的高成本問題。目前，為了保證內(nèi)部微流道潔凈，只能一次性使用的液滴微流控芯片的成本仍然過高，使得整個液滴dPCR技術的檢測成本高昂，影響了液滴dPCR技術的普及。微流控芯片成本的絕大部分源自微加工技術和芯片材料，相信未來隨著微流控技術的高速發(fā)展，各種低成本的微加工方法的不斷涌現(xiàn)和各類低成本材料的使用，會在很大程度上降低液滴dPCR技術的成本。從降低成本方面考慮，研發(fā)應用于液滴dPCR技術中的高通量、低成本微流控芯片也必將是未來的發(fā)展方向之一。

文獻鏈接：DOI: 10. 11895 / j. issn. 0253-3820. 160074

（文章來源:分析化學 (FENXI HUAXUE) 評述與進展 作者：范一強* 王玫 高峰 莊儉 唐剛 張亞軍 科學網(wǎng)科學網(wǎng)轉(zhuǎn)載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯(lián)系刪除）