微流控芯片(microfluidics)又稱芯片實驗室(labonachip),是將化學(xué)和生物等領(lǐng)域所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測等基本操作單元集成到幾個平方厘米大小的具有微米級通道結(jié)構(gòu)的芯片上,采用可控流體,完成常規(guī)化學(xué)和生物實驗室的各種功能的一種微技術(shù)平臺。微流控芯片具有小型化、集成化、高通量、低能耗、分析快速等特性。自20世紀(jì)90年代初,微流控芯片以芯片毛細(xì)管電泳的形式出現(xiàn)以來,目前已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)保和新藥研究等領(lǐng)域。

有別于以靜態(tài)親和雜交為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)生物芯片,微流控芯片采用微流體控制技術(shù),為動態(tài)生物分析提供了一個嶄新的技術(shù)平臺。微流控芯片在生物領(lǐng)域的應(yīng)用可分為分子水平和細(xì)胞水平。細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位,一切有機體(除病毒外)都由細(xì)胞構(gòu)成,對細(xì)胞的深入研究是揭開生命奧秘和治療疾病的關(guān)鍵所在。雖然以毛細(xì)管電泳和流式細(xì)胞儀為代表的細(xì)胞分析儀器被普遍應(yīng)用,但功能單一,而且存在各自的不足。例如,毛細(xì)管電泳不易對細(xì)胞操控和處理,流式細(xì)胞儀耗費大量樣品等。微流控芯片在細(xì)胞學(xué)研究方面具有以下一些優(yōu)點:第一,微流控芯片通道尺寸(10~100μm)與單個細(xì)胞直徑(10~20μm)大小相近,便于對細(xì)胞進行操控;第二,微流控芯片的多維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成相對封閉的環(huán)境,更接近生理狀態(tài)下細(xì)胞的生存環(huán)境;第三,微流控芯片可以滿足高通量細(xì)胞分析的需要,可同時獲取大量的生物學(xué)信息;第四,微流控芯片上多種操作單元靈活組合,使得細(xì)胞進樣、培養(yǎng)、捕獲、裂解和分離檢測等過程在一塊芯片上即可完成;第五,微流控芯片為平板式幾何構(gòu)型,更方便進行觀察;第六,芯片上傳熱和傳質(zhì)快,有利于熱量和物質(zhì)的擴散。由于微流控芯片能在試驗條件下模擬生理條件,為在單細(xì)胞和多細(xì)胞水平更好地研究細(xì)胞提供了一個全新的技術(shù)平臺。本文對近年來微流控芯片在細(xì)胞生物學(xué)研究中的一些主要應(yīng)用,包括細(xì)胞的培養(yǎng)、分選、裂解、凋亡、計數(shù)、遷移、單細(xì)胞捕獲和細(xì)胞間相互作用等進行了綜述。

1.細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞生物學(xué)、組織工程、生物醫(yī)學(xué)工程和藥物開發(fā)中的關(guān)鍵步驟。在傳統(tǒng)的體外細(xì)胞培養(yǎng)中,細(xì)胞多為貼壁和二維生長,由于離體后的細(xì)胞失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞之間的相互作用,而且處于相對靜止的環(huán)境中,所以細(xì)胞除了增殖外并沒有像在體內(nèi)那樣發(fā)揮其作用,也不能真實反映其在體內(nèi)的生存情況。微流控芯片和傳統(tǒng)的體外細(xì)胞培養(yǎng)相比,具有很多優(yōu)點,諸如:精確控制物質(zhì)濃度、溶液溫度和pH值等細(xì)胞微環(huán)境要素;提供微小和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)來模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生存環(huán)境;提供三維生長環(huán)境以模擬細(xì)胞在體內(nèi)的狀態(tài),考察細(xì)胞的行為(如基因表達(dá)、受體作用和其它生命活動)等。在哺乳動物組織中,細(xì)胞的生長受到多方面因素的影響,不僅細(xì)胞之間存在相互作用,細(xì)胞與胞外基質(zhì)也有密切聯(lián)系,同時細(xì)胞還受到各種自分泌、旁分泌及激素等信號分子的作用。因此建立細(xì)胞體外三維培養(yǎng)環(huán)境,需要將細(xì)胞植入模擬細(xì)胞外基質(zhì)的培養(yǎng)環(huán)境中。目前有天然和合成的水凝膠已被成功整合到芯片上,但與此同時也出現(xiàn)一些問題,如操作復(fù)雜和阻礙物質(zhì)的傳輸。為解決這些問題,Ong等設(shè)計了橢圓形微柱陣列的芯片(圖1A)。細(xì)胞預(yù)先用高碘酸鈉處理,使其表面的糖蛋白產(chǎn)生醛基,再與培養(yǎng)液中的聚乙烯亞胺酰肼(polyethyleneimine-hydrazide)連接物結(jié)合形成三維生長結(jié)構(gòu),最后,用鈣黃綠素和碘化丙啶染色后,觀察細(xì)胞的生長情況。另外,Huang等設(shè)計了一款自動培養(yǎng)細(xì)胞的芯片(圖1B),通過設(shè)置氣動微泵和微閥使培養(yǎng)液和緩沖液流入細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域,同時將代謝廢物排出。芯片中的柵欄形微型加熱器和溫度感應(yīng)器能提供一個較恒定的溫度(37?C±1?C)。羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液則為細(xì)胞生長提供適宜的pH條件。Nevill等設(shè)計制備微流控芯片,將細(xì)胞培養(yǎng)和電化學(xué)裂解功能結(jié)合在一起,對細(xì)胞中的蛋白(p53和HRP)進行分析,大大降低了分析時間和成本。在微流控芯片上還可以進行肝、肺細(xì)胞和組織培養(yǎng),構(gòu)建體外毒理實驗?zāi)Ｐ?/span>。除此之外,微流控芯片還可以用于干細(xì)胞和癌細(xì)胞的培養(yǎng)。由于干細(xì)胞生活在復(fù)雜的物理、化學(xué)和生物因素下,傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法不能很好地模擬其生理環(huán)境,并受到各種限制,而微流控芯片技術(shù)可以更好地模擬干細(xì)胞在體內(nèi)復(fù)雜的生活環(huán)境,以高通量和可變方式精確控制各種參數(shù)。癌細(xì)胞最大的特點是侵襲和轉(zhuǎn)移,利用微流控芯片可以模擬癌細(xì)胞滲入血管、在血管內(nèi)隨血液循環(huán)流動、滲出血管和遷移到靶組織等一系列過程。由此可見,采用微流控芯片來培養(yǎng)細(xì)胞將成為細(xì)胞生物學(xué)研究的一個重要手段。

A:非水凝膠3D微流控細(xì)胞培養(yǎng)體系包括兩個入口(一個是培養(yǎng)基入口,另一個是細(xì)胞灌注入口)和一個出口。微壩結(jié)構(gòu)將微流控通道分為中心細(xì)胞培養(yǎng)室和兩邊用來擴散培養(yǎng)基的通道兩部分;B:細(xì)胞自動培養(yǎng)體系圖解說明,此體系由一個細(xì)胞培養(yǎng)室,四個微泵、四個微閥、微通道、儲液池、兩個加熱器和一個微型溫度傳感器組成。

2.細(xì)胞分選

細(xì)胞分選是從非均一細(xì)胞體系中篩選出性質(zhì)均一細(xì)胞的技術(shù),在細(xì)胞免疫學(xué)和臨床診斷中具有非常重要的作用。目前最常用的細(xì)胞分選方法有磁珠免疫法和流式細(xì)胞儀法,其中磁珠免疫法對細(xì)胞表面有特異性要求,而流式細(xì)胞儀雖然能對細(xì)胞進行快速可靠的分選,但其體積龐大、價格昂貴、難以滅菌。除此之外還需要專業(yè)人員操作和復(fù)雜的前處理過程,并伴隨大量的樣本消耗。為了彌補這些缺陷,有報道將流式細(xì)胞儀的主要部件與微流控芯片結(jié)合起來,從而實現(xiàn)小型化和低成本分選細(xì)胞。

目前,以微流控芯片技術(shù)為平臺的細(xì)胞分選方法主要有兩種:

(1) 以微結(jié)構(gòu)和層流為基礎(chǔ)的被動分選;

(2)以各種外力(如磁力、介電電泳力、電動力等)驅(qū)動的主動分選。

2.1以細(xì)胞大小為基礎(chǔ)的過濾分選

借助微型機電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù),Chen等設(shè)計和制造的立柱型和堤壩型過濾芯片,依靠平行的微立柱和微壩尺寸大小來分離細(xì)胞。圖2A所示的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片利用紅細(xì)胞與白細(xì)胞體積大小的差異將紅細(xì)胞從大鼠全血中分離出來,在主通道的垂直方向設(shè)置了微型堤壩,兩者存在5?m的高度差,當(dāng)緩沖液沿垂直主通道方向灌流時,紅細(xì)胞被沖到側(cè)面,經(jīng)過微型堤壩結(jié)構(gòu)流入收集池里。圖2B所示芯片在主通道內(nèi)兩側(cè)設(shè)計了兩排直徑20μm、間隔6.5μm的立柱,圓餅狀、體積較小的紅細(xì)胞能通過立柱間的縫隙進入兩邊的通道,而圓球狀的體積較大的白細(xì)胞則留在主通道內(nèi),從而達(dá)到分選效果,與此同時,連續(xù)流動的溶液將白細(xì)胞沖到出口處,避免微通道發(fā)生堵塞。

2.2受介電電泳作用的細(xì)胞分選

介電電泳是指本身不帶電、但可以發(fā)生不同程度極化的顆粒在非均勻的電場中移動的現(xiàn)象。與電泳分離不同,介電電泳不是依靠粒子的荷質(zhì)比,而是依據(jù)不同介電性質(zhì)對顆粒進行分離。當(dāng)處于非均勻電場時,細(xì)胞產(chǎn)生極化現(xiàn)象,其表面會發(fā)生偶極矩作用,進而細(xì)胞在介電電泳力作用下,向高場強(正向介電電泳)或低場強(負(fù)向介電電泳)方向移動。由于細(xì)胞的大小、形狀、介電性質(zhì)不同,細(xì)胞所受介電電泳力的大小和方向也不盡相同,因此可對細(xì)胞進行分選。

以微流控芯片介電電泳為基礎(chǔ)的分選技術(shù)具有很多優(yōu)點:

(1) 所需技術(shù)成本低;

(2) 不需要對細(xì)胞表面進行修飾;

(3) 操作簡便;

(4) 特異性高等。

基于以上優(yōu)點,在微流控芯片上進行介電電泳已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分選。Nascimento等利用芯片介電電泳對受寄生蟲侵染和未被侵染的紅細(xì)胞進行分選。當(dāng)紅細(xì)胞受到侵染后,其細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和表面抗原會發(fā)生變化,細(xì)胞膜通透性提高,使兩種細(xì)胞在電場中受力大小和方向不同,導(dǎo)致運動方向發(fā)生改變,進而獲得分離。為了在芯片上實現(xiàn)介電電泳必須產(chǎn)生非均勻電場,如圖2C所示,X型的絕緣結(jié)構(gòu)用于產(chǎn)生非均勻電場,通過改變電壓和液體流速,收集HeLa細(xì)胞。Pommer等在微流控芯片上設(shè)計了兩個非均勻電場,對樣品中的細(xì)胞進行串聯(lián)介電電泳分離,從全血樣品中獲得了純度為95%的血小板。

2.3光驅(qū)動的細(xì)胞分選

用光作用力進行細(xì)胞分選主要有熒光激發(fā)和光鑷兩種形式。熒光激發(fā)的細(xì)胞分選是將目標(biāo)細(xì)胞預(yù)先進行熒光標(biāo)記,經(jīng)過檢測區(qū)域時目標(biāo)細(xì)胞被識別,在激光束作用下使目標(biāo)細(xì)胞進入選擇通道。Wang等在微流控芯片上以熒光激發(fā)的方式,將被綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞分選出來,如圖2D所示,當(dāng)樣品流經(jīng)檢測區(qū)域時,光電二極管檢測到細(xì)胞的存在,接著光電倍增管對細(xì)胞所發(fā)熒光進行分析,聲光調(diào)制器觸發(fā)光學(xué)開關(guān)將表達(dá)綠色熒光的HeLa細(xì)胞送入收集通道。光鑷是一種光效應(yīng),激光聚集可形成光阱,微小物體受光壓而被束縛在光阱處,移動光束使微小物體隨光阱移動,借此可在顯微鏡下對微小物體操控。如圖2E所示,在光鑷芯片上,細(xì)胞樣本被數(shù)字成像系統(tǒng)檢測、識別、追蹤,以產(chǎn)生的可控信號為基礎(chǔ),利用激光光鑷,目標(biāo)細(xì)胞自動轉(zhuǎn)入鄰近的鞘流,最終被分流到下游收集區(qū)域。

2.4磁性細(xì)胞分選

磁性分選在芯片細(xì)胞分選中尤其受歡迎,因為磁力對細(xì)胞活力的影響最小。磁性細(xì)胞分選的原理是:在目標(biāo)細(xì)胞表面包裹磁性微粒[38]或?qū)⒋判约{米顆粒引入細(xì)胞內(nèi)部,從而使其帶上磁性標(biāo)簽,當(dāng)帶有磁性標(biāo)簽的細(xì)胞流經(jīng)磁場區(qū)域時,磁力使目的細(xì)胞偏離原來的運動軌道。由于不同細(xì)胞的大小、磁化率、流速不同,細(xì)胞偏離原來層流方向的程度不同,從而將細(xì)胞分選出來。微流控芯片上的磁性細(xì)胞分選可以實現(xiàn)對兩種及多種細(xì)胞的分選,可以將待分選的細(xì)胞用磁性標(biāo)簽標(biāo)記,其余細(xì)胞不做標(biāo)記,當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞流經(jīng)磁場區(qū)域時運動方向發(fā)生改變,從而被分離出來;也可以將多種細(xì)胞施加不同磁性標(biāo)簽以達(dá)到分選目的。Adams等就在微流控芯片連續(xù)層流基礎(chǔ)上實現(xiàn)了同時對多種細(xì)胞進行空間定位分選,如圖2F所示,細(xì)胞在進樣之前用不同磁性標(biāo)簽標(biāo)記,流經(jīng)磁場區(qū)域時,不同細(xì)胞在磁力和流體驅(qū)動力的合力作用下流向不同的收集通道,最后在收集通道將細(xì)胞用洗脫液洗脫出來,從而達(dá)到細(xì)胞分選的目的。

A:用于分選血細(xì)胞的PMMA微流控芯片。左圖為微流控芯片整體示意圖,共有7個口,1:注血口;2-4:緩沖液注入口;5,6:紅細(xì)胞收集口;7:廢液口。右圖為分選區(qū)域局部放大圖;B:用于分選細(xì)胞的連續(xù)流動微流控芯片。左圖為立柱型分選血細(xì)胞芯片概略圖,a:血液樣品注入口,b:白細(xì)胞收集口;c:紅細(xì)胞和血漿收集口;右圖為裝置末端微立柱陣列掃描電鏡圖;C:負(fù)向介電電泳分離HeLa細(xì)胞的微流控芯片;D:熒光激發(fā)的微流控芯片細(xì)胞分選示意圖,細(xì)胞流經(jīng)中心通道時,經(jīng)過分析轉(zhuǎn)換,靶細(xì)胞流向收集口,而其他細(xì)胞流入廢液口;E:自動化細(xì)胞分選系統(tǒng)設(shè)計圖。當(dāng)細(xì)胞通過興趣區(qū)時,數(shù)字圖像處理系統(tǒng)產(chǎn)生信號,激發(fā)激光光鑷,將目的細(xì)胞從樣品中分離出來;F:多靶標(biāo)磁性細(xì)胞分選結(jié)構(gòu)。樣品中含有過量的非目標(biāo)細(xì)胞和2個不同的靶細(xì)胞(目標(biāo)1和目標(biāo)2),靶細(xì)胞分別用特定標(biāo)簽(標(biāo)簽1和標(biāo)簽2)標(biāo)記,細(xì)胞在MFS1和MFS2產(chǎn)生高梯度磁場區(qū)域發(fā)生分離

微流控芯片技術(shù)自20世紀(jì)90年代出現(xiàn)以后,隨著生物、材料、化學(xué)、物理工程和電子工程等學(xué)科的介入,目前已取得了巨大的發(fā)展,其最終目的是建立多功能芯片實驗室。微流控芯片技術(shù)正以其獨特的優(yōu)勢越來越多地應(yīng)用到細(xì)胞生物學(xué)研究中,其不僅可以為細(xì)胞提供可控制的生存微環(huán)境,與其他分析方法結(jié)合檢測細(xì)胞內(nèi)生化過程,而且在細(xì)胞個體、細(xì)胞群體和多細(xì)胞生命體三個層次對細(xì)胞的生命活動進行深入研究。另一方面,微流控芯片仍處于發(fā)展初期,許多方面的技術(shù)還不成熟,如不能進行長期細(xì)胞培養(yǎng);細(xì)胞三維培養(yǎng)中一些水凝膠和粘連蛋白的引入可能阻塞通道和妨礙物質(zhì)傳輸;電裂解細(xì)胞時產(chǎn)生的焦耳熱和氣泡會影響細(xì)胞生長和代謝等。目前微流控芯片大多處于實驗室概念化論證階段,尚未達(dá)到理想的商業(yè)化和通用化程度;對微流控芯片技術(shù)了解不多的生物研究人員,應(yīng)用起來還有一定的困難。但是,基于微流控芯片的突出優(yōu)點和人們對新技術(shù)的需求,我們相信微流控芯片細(xì)胞實驗室將成為細(xì)胞生物學(xué)研究的重要平臺。

（文章節(jié)選自：微流控芯片技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用進展 作者：姚　琳　白亮　吳亮其　丁永勝* 科學(xué)網(wǎng)科學(xué)網(wǎng)轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除）