多種單細(xì)胞共培養(yǎng)可以模擬與生物體內(nèi)相似的微環(huán)境。但傳統(tǒng)方法耗費(fèi)大量的試劑及資源，且不便于實(shí)時(shí)觀察及后續(xù)檢測(cè)。微流控技術(shù)為細(xì)胞體外培養(yǎng)注入新的活力。采用微流 控技術(shù)采微細(xì)加工工藝制作的細(xì)胞培養(yǎng)載體可 以在很大程度上克服傳統(tǒng)方式的不足。通過(guò)加工通道特征尺寸在 10–100 μm 的細(xì)胞培養(yǎng)微芯片可以極大地限制培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量，彌補(bǔ)傳統(tǒng) 細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不能動(dòng)態(tài)操控和實(shí)時(shí)觀察的不足；而且由于其有效的熱質(zhì)傳輸效率，能夠更加有效地反映體內(nèi)環(huán)境。

通過(guò)加工具有特定功能的芯片三維空間結(jié)構(gòu)，可以有效控制細(xì)胞的空間位置。Zhou等研究了肝細(xì)胞及星狀細(xì)胞的共培養(yǎng)及其對(duì)酒精刺激的作用，Harper 等探究了癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞的 實(shí)時(shí)作用。

據(jù)報(bào)道，腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞所 處的內(nèi)外環(huán)境有著密切關(guān)系。它不僅包括腫瘤所在組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，而且亦與腫瘤細(xì)胞自身的內(nèi)在環(huán)境有關(guān)。腫瘤血管生成是腫瘤細(xì)胞生存的基礎(chǔ)，而腫瘤血管形成依賴于內(nèi) 皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí)與腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞 也是腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵細(xì)胞。本文設(shè)計(jì)和制 作具有“微壩”和“微縫”結(jié)構(gòu)的細(xì)胞共培養(yǎng) 微流控芯片，具有細(xì)胞圖形化的特點(diǎn)和功能， 有效地解決細(xì)胞共培養(yǎng)中無(wú)序混合、摻雜生長(zhǎng) 等問(wèn)題。本研究選擇人肺腺癌細(xì)胞、人胚肺成 纖維細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞 在特定空間生長(zhǎng)繁殖，能夠滿足實(shí)時(shí)觀測(cè)的需求， 為進(jìn)一步研究肺癌微環(huán)境提供有效的技術(shù)平臺(tái)。

1 方法

1.1 微通道內(nèi)流體力學(xué)分析

在流體力學(xué)中，流體流態(tài)一般用雷諾數(shù)(Re) 表示：

Re=ud/v

其中，u為對(duì)應(yīng)流體的速度，d為流體管道內(nèi)徑，v為對(duì)應(yīng)流體的運(yùn)動(dòng)粘度(v=μ/ρ，ρ為對(duì)應(yīng)流體的密度，μ為流體的動(dòng)力粘度)；雷諾數(shù)是量綱為1的量，其數(shù)值的大小可反映單相流體的流態(tài)，當(dāng)Re < 2 000，流體呈層流狀態(tài)，在芯片內(nèi)部，微通道是微米級(jí)別，其流體雷諾數(shù)一般小于1，故其內(nèi)部流體仍屬于層流狀態(tài)，如圖 1所示，其內(nèi)部主流部分用紅色箭頭示意，即主流與通道結(jié)構(gòu)保持一致，有部分流體流經(jīng)“微壩”下的“微縫”區(qū)域，這也是“C型微壩”可截留目標(biāo)細(xì)胞的流體力學(xué)基礎(chǔ)。

圖1 芯片內(nèi)部微通道流體流向三維示意圖

1.2 細(xì)胞共培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)及芯片工作原理

本設(shè)計(jì)中，要求微流控芯片能夠有效在特 定位點(diǎn)“截留”細(xì)胞。通過(guò)在對(duì)應(yīng)區(qū)域設(shè)計(jì)“微 壩”結(jié)構(gòu)攔截不同種類細(xì)胞而不互相混雜，從而實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞間的物理隔離。通過(guò)不足 10 μm 的微縫隙攔截到直徑大于 10 μm 的細(xì)胞個(gè)體。 細(xì)胞尺寸量級(jí)在 10–100 μm，與光刻膠厚度量級(jí)契合，在尺度上可與微流控芯片良好結(jié)合， 可通過(guò)控制涂膠厚度實(shí)現(xiàn)不同大小的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究需求。圖 2 為微流控芯片單元設(shè)計(jì)示意 圖，圖 A 為微通道剖面圖，示意含有細(xì)胞的培 養(yǎng)液流經(jīng)聚二甲基硅氧烷(PDMS) 與玻璃基底 之間的通道，可較好地被微通道內(nèi)部突起的 C 型 攔截壩截留；微縫寬度不到 10 μm，可攔截細(xì)胞； 圖 B 表明細(xì)胞能夠停留在目標(biāo)區(qū)域，即 C 型攔截 壩。由于微縫的作用，培養(yǎng)基中小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 可以自由流通，實(shí)現(xiàn)各個(gè)區(qū)域細(xì)胞的獨(dú)立培養(yǎng)。

圖 2 芯片結(jié)構(gòu)示意圖

2 微流控芯片

2.1 微流控芯片的制作方法

采用 piranha 清洗方法 (濃硫酸和過(guò)氧化 氫比例為 7∶3) 對(duì)硅片表面進(jìn)行清潔處理。根據(jù)設(shè)計(jì)要求將涂覆有 SU8光刻膠的硅片置于甩膠機(jī)上，分預(yù)甩和甩膠兩步，在其表面旋涂致密均勻的既定厚度的膠膜；采用熱板加熱的方 式來(lái)對(duì)硅片進(jìn)行前烘處理，前烘是為了去除膠體中適量溶劑，增強(qiáng)光刻膠的粘黏性。采用 直接接觸式曝光，根據(jù)膠膜厚度不同選擇相應(yīng) 的曝光時(shí)間，確保掩膜板的光面與硅基襯底緊 密貼合，這一過(guò)程可將掩膜板上的圖形轉(zhuǎn)移到 硅片上。后烘可促進(jìn)光刻膠內(nèi)部化學(xué)反應(yīng)的進(jìn) 行，從而使其部分區(qū)域交聯(lián)；將后烘過(guò)的硅 片放置于盛有丙二醇甲醚醋酸酯溶液 (PGMEA) 中進(jìn)行顯影反應(yīng)，可將硅片放入異丙醇溶液中， 如果沒(méi)有出現(xiàn)白膜則說(shuō)明反應(yīng)已完全。然后用去離子水洗凈，N2 吹干。為了降低硅基模具表面親和性，便于后續(xù)工藝脫模，將硅片放置在含有少量氟硅烷溶液的真空干燥器中，于 通風(fēng)櫥中抽真空后，靜置過(guò)夜后得到芯片模具。 其制備工藝流程如圖 3 所示。將 PDMS 與固化劑按 10∶1 (重量比) 混合均勻，于真空干燥器 抽真空至氣泡完全消失，在水平臺(tái)面上澆注 PDMS，置于熱板 85 ℃烘焙 30 min，自然冷卻 至室溫，小心從襯底上剝離，打孔切片后備用。 將制備好的 PDMS 芯片與 1 mm 載玻片表面進(jìn)行等離子處理，然后鍵合得到微流控芯片。

圖 3 微流控芯片制備工藝

2.2 微流控芯片相關(guān)表征

芯片內(nèi)部通道的連通性，使用紅色染料灌注測(cè)試，如圖 4A 所示，微通道內(nèi)部高低錯(cuò)落， 結(jié)構(gòu)分明，圖 4B 中可以看出，通道內(nèi)部的深紅 色表明主流流經(jīng)區(qū)域，而通道之間的淺紅色部分 表明各通道相應(yīng)區(qū)域本質(zhì)“連通”。連通的液體 可為物理隔離的各種細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng) 物質(zhì)，維持其生命活動(dòng)。其中細(xì)胞培養(yǎng)單元中細(xì) 胞攔截區(qū)域即“C 型壩”半徑為 90 μm，“壩高” 約為 42 μm，微通道寬度為 80 μm，高約 50 μm。

圖4 細(xì)胞芯片圖像 (A：實(shí)物圖；B：?jiǎn)卧鈱W(xué)圖； C 和 D：SEM 圖像)

3 基于微流控平臺(tái)的細(xì)胞共培養(yǎng)

3.1 前處理

對(duì)于微流控芯片，其前處理主要目的是在芯片內(nèi)部營(yíng)造適宜細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖的微環(huán)境，步驟主要包括：滅菌及孵育。將芯片在75%乙醇溶液中浸泡1 h，抽真空處理，置于紫外燈下光照滅菌。使用注射泵以一定流速向芯片內(nèi)部通道注入完全培養(yǎng)基，于CO2培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜。

3.2 細(xì)胞導(dǎo)入和培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)采用人胚肺成纖維細(xì)胞(HFL1，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))、人肺腺癌細(xì)胞(A549，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs，ATCC) 三種細(xì)胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)培養(yǎng)基采用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(10%胎牛血清、0.1%鏈青雙抗)，培養(yǎng)溫度設(shè)定37.0 ℃，CO2濃度為5%。

將培養(yǎng)皿中已貼壁細(xì)胞進(jìn)行消化，離心后重懸，得到適宜濃度的細(xì)胞重懸液(濃度約1×106cells/mL)；采用注射泵正壓注入的方法向經(jīng)前處理的芯片中導(dǎo)入細(xì)胞，由于細(xì)胞懸液長(zhǎng)時(shí)間放置很容易產(chǎn)生細(xì)胞聚沉，造成細(xì)胞進(jìn)樣的不穩(wěn)定及不連續(xù)性。通過(guò)多次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，將導(dǎo)入過(guò)程控制在10 min以內(nèi)較有利于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行；同時(shí)通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中芯片內(nèi)部各區(qū)域的觀察，也確定了細(xì)胞懸液進(jìn)樣速率與區(qū)域分布的關(guān)系，如表 1所示。將進(jìn)樣速率控制在0.3-0.8 mL/h既能夠使細(xì)胞充分填布相應(yīng)攔截區(qū)域，又不至于通道內(nèi)部流速過(guò)大將其“沖走”。圖 5A中流速0.2 mL/h，為過(guò)填充，圖 5B流速0.5 mL/h，為理想填充，圖 5C流速1.2 mL/h，表明細(xì)胞溢出相應(yīng)區(qū)域。

表1 細(xì)胞懸液進(jìn)樣流速控制

圖5 不同流速控制下細(xì)胞進(jìn)樣圖像

4 結(jié)果與分析

基于微流控平臺(tái)的芯片制備，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室相關(guān)制備條件參數(shù)，經(jīng)過(guò)清洗、烘干、涂膠、 甩膠、前烘、曝光、后烘、顯影和堅(jiān)膜等一系列工藝步驟之后，得到硅基芯片模具。通過(guò)在模具上澆注 PDMS，熱烘固化后使用等離子清洗機(jī)對(duì) PDMS和玻璃載玻片進(jìn)行表面處理后即為不可逆鍵合，最終得到一批較為良好的微流控細(xì)胞共培養(yǎng)芯片。對(duì)所得微流控芯片進(jìn)行相應(yīng)生物學(xué)處理，主要目的在于滅菌，使其內(nèi)部通道微環(huán)境適于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。在細(xì)胞懸液灌 注過(guò)程中，可明顯看到微通道內(nèi)部分細(xì)胞依次停留在“微壩”區(qū)域，且排列緊湊 (圖 6)，具 有細(xì)胞構(gòu)圖的功能。在導(dǎo)入細(xì)胞懸液后，經(jīng)過(guò) 一定時(shí)間 (不同細(xì)胞貼壁時(shí)間有所差異)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞貼壁后，其形態(tài)發(fā)生變化，表現(xiàn)出增殖、遷移等行為。將 HUVECs、HFL-1 及 A549 共培養(yǎng)于微流控芯片中，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況 良好 (圖 7，8)。

圖6 細(xì)胞導(dǎo)入過(guò)程圖

圖 7 三種細(xì)胞在芯片腔體內(nèi)共培養(yǎng) (24 h)

圖8 在芯片腔體內(nèi)各細(xì)胞形態(tài)圖 (24 h)

本文基于微流控制作平臺(tái)，通過(guò)軟光刻技術(shù)，制備一批用于細(xì)胞共培養(yǎng)的微流控芯片。Chung等通過(guò)在微芯片內(nèi)部放置凝膠物質(zhì)，探究了共培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞向凝膠內(nèi)部遷移行為。Patel等通過(guò)設(shè)計(jì)灌注有聚乙二醇的中間通道驗(yàn)證兩側(cè)微腔室內(nèi)相關(guān)癌細(xì)胞旁分泌相互作用。本文中具有“微壩”結(jié)構(gòu)連通區(qū)域的芯片可起到在特定區(qū)域攔截細(xì)胞的作用；通過(guò)設(shè)計(jì)“微壩”及“微縫”位置及結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)無(wú)內(nèi)置凝膠狀態(tài)下，同一空間特定位置培養(yǎng)特定細(xì)胞層，有效避免細(xì)胞共培養(yǎng)中無(wú)序混合，摻雜生長(zhǎng)等問(wèn)題。在此基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)一步探究各種類細(xì)胞間相互作用，連續(xù)、動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)觀察其相互作用后的形態(tài)學(xué)變化。本研究為共培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞遷移及相互作用、腫瘤微環(huán)境模擬提供一種新的有效實(shí)驗(yàn)思路，而且也可為后續(xù)開(kāi)展藥物篩選、新藥研發(fā)提供支持。

文獻(xiàn)鏈接：

王帥超, 葛玉卿, 吳蕾,等. 三種細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片的設(shè)計(jì)和制作. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(2): 294-300

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