近幾年來，微全分析系統(tǒng)技術(shù)日益受到人們關(guān)注,廣泛應(yīng)用于生化分析和細胞學研究領(lǐng)域。μTAS技術(shù)應(yīng)用于細胞學研究的一個重要發(fā)展方向是開發(fā)細胞培養(yǎng)微系統(tǒng),用于細胞遷移,細胞分化貝藥物篩選等。與常規(guī)細胞體外培養(yǎng)技術(shù)相比,利用細胞培養(yǎng)微系統(tǒng)培養(yǎng)細胞能夠較好地模擬細胞體內(nèi)生長的微環(huán)境。然而,在設(shè)計細胞培養(yǎng)芯片時,必須考慮芯片材料的生物兼容性、培養(yǎng)液流動導(dǎo)致的機械力對細胞的影響和有效成分的傳遞輸送等因素其中,如何通過簡單快速的微細加工工藝加工生物兼容性良好的材料，是需要解決的首要問題。

目前用于加工細胞培養(yǎng)芯片的材料主要有硅、玻璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS等聚合物材料）。PDMS芯片通常采用復(fù)制壓模技術(shù)制作",能夠?qū)崿F(xiàn)微米級圖案的高保真復(fù)制,并且具有良好的生物兼容性,可直接培養(yǎng)各類細胞。但PDMS是彈性材料，易受有機試劑作用產(chǎn)生微通道變形、溶脹等現(xiàn)象;且PDMS管道表面為疏水性,很難潤濕親水性溶液,在培養(yǎng)液進樣過程中容易產(chǎn)生氣泡而損傷細胞。

與PDMS材料相比,玻璃材質(zhì)芯片具有良好的親水性能、力學性能,且制作設(shè)備與傳統(tǒng)集成電路(IC)工藝設(shè)備相兼容。但目前制作玻璃芯片，是在玻璃基底上濺射一層金屬或多晶硅等薄膜材料作為刻蝕掩模層,然后進行濕法或干法刻蝕,最后在超凈環(huán)境中利用高電壓或高溫進行鍵合同整個加工工藝復(fù)雜，價格昂貴。

為了綜合利用玻璃材料和PDMS材料的優(yōu)點，我們提出了一種基于玻璃濕法腐蝕過程中的鉆蝕效應(yīng)叫,廉價、快速地制作玻璃細胞培養(yǎng)芯片的方法。以商品化的氧化銦錫透明導(dǎo)電玻璃為芯片基質(zhì)，以一層AZ4620光刻膠作為玻璃刻蝕的掩模層,以BOE液為玻璃腐蝕液,通過上膠、曝光、顯影、腐蝕、去膠、鍵合等步驟獲得細胞培養(yǎng)芯片。其中,蓋片仍采用PDMS材料,以利用它的透氣性特質(zhì)。采用ITO玻璃有利于集成加熱系統(tǒng),滿足細胞長期觀察和記錄細胞活動的需要。最后,將該芯片與溫度控制系統(tǒng)、視頻觀察系統(tǒng)等整合,培養(yǎng)豬髂骨動脈內(nèi)皮細胞,證實了該方法的可行性和系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1 材料和方法

1.1 材料

細胞培養(yǎng)芯片的基質(zhì)材料為商品化的ITO玻璃;刻蝕掩模層采用正性光刻膠AZ4620(AZ photoresist products美國):PDMS單體為Sylgard184 Dow Coming美國);細胞培養(yǎng)芯片加工過程中所用化學試劑均為分析純產(chǎn)品,玻璃腐蝕液為BOE液。

1.2微流控芯片的加工

以 ITO玻璃為基質(zhì)材料的細胞培養(yǎng)芯片制作主要包括掩膜板制作、ITO玻璃清洗,曝光、刻蝕、鍵合等步驟,見圖1。

圖1 玻璃芯片的制作過程

1.2.1掩模板制作 芯片掩模板如圖2所示。進樣孔1、3之間距離為14mm,用于導(dǎo)入細胞,管道狹窄處寬度為200μm,其他為細胞培養(yǎng)區(qū)域，寬度為800 μm:2.4間管道為培養(yǎng)液導(dǎo)入通道,寬150 μm,總長14mm。培養(yǎng)液通道和細胞培養(yǎng)區(qū)域之間距離為190μm,用于加工后續(xù)的壩型”結(jié)構(gòu)。

1.2.2 ITO玻璃清洗 將ITO玻璃先用丙酮和酒精超聲清洗,再用去離子水沖洗干凈,放入130C的烘箱中烘烤1h，去除附著在玻璃表面的水蒸汽。

1.2.3曝光、顯影 ITO玻璃的一側(cè)已濺射一層厚度為35mm的ITO薄膜,其功能為導(dǎo)電發(fā)熱,另一側(cè)則與普通玻璃無異。在沒有 ITO薄膜的玻璃一側(cè)甩涂AZ4620光刻膠。甩膠結(jié)束,將ITO玻璃置于80C烘箱內(nèi)軟烘30min此時光刻膠厚度為6~7μm。軟烘結(jié)束,利用光刻機對玻璃基底進行紫外曝光。曝光后的ITO玻璃用顯影液AZ400K顯影，顯影過程中不斷晃動ITO玻璃,使顯影液與被曝光的感光膠充分接觸,加速感光膠和基底的分離。顯影至被曝光部分的光刻膠完全去除為止。

1.2.4刻蝕 將顯影完成后的ITO玻璃置于130C的烘箱中硬烘30min硬烘過程可以降低光刻膠與玻璃基底的殘余應(yīng)力,蒸發(fā)去除光刻膠內(nèi)的有機溶劑，增加光刻膠掩模層與玻璃基底表面的黏附力。由于ITO薄膜耐腐蝕效果較差,其在以50:503比例配置的HO HCIHNO腐蝕液中耐受時間約為40s因此,在硬烘完成,進行濕法腐蝕之前,需要對玻璃基底的ITO薄膜進行保護,以避免在刻蝕過程中BOE液將此薄膜腐蝕去除。保護方法如圖1⑤所示,將PDMS單體和固化劑以10：1混合均勻,脫氣處理后澆注在ITO薄膜一側(cè)，80C固化1h待固化完成,將此玻璃基底置于BOE腐蝕液中進行刻蝕，刻蝕過程中通過磁力攪拌器不斷攪拌,以形成所需要的微管道結(jié)構(gòu)。腐蝕完畢,去除用于保護作用的PDMS薄層,即得到已刻蝕好微管道的玻璃基片,如圖3所示。

1.2.5 PDMS 薄膜蓋片制作將PDMS單體與固化劑按10:1的比例均勻混合后,脫氣處理。將脫氣處理后的PDMS澆注在水平放置的載玻片上，80℃固化1h。固化完成,切割成合適的大小用于后續(xù)與玻璃基片的鍵合。PDMS薄膜厚度為1mm。

1.2.6 鍵合 刻蝕完成后的玻璃基片上的通道為開放性結(jié)構(gòu)，將其與其他平整表面鍵合即可形成密閉的培養(yǎng)通道。將此玻璃基片與上一步驟制得的PDMS薄膜置于等離子體刻蝕儀內(nèi)，抽真空后通入氧氣,施加射頻電壓,取出玻璃基片和PDMS薄膜，小心粘合即完成兩者的不可逆鍵合。

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