為了量化納米結(jié)構(gòu)內(nèi)的滑移速度和渦流強(qiáng)度，我們估計(jì)了扁平PET、PSNF和BSNF的渦度強(qiáng)度和平均速度分布（圖3g-i）。速度剖面顯示，PSNF表現(xiàn)出相當(dāng)大的滑移速度和滑移長(zhǎng)度（y截距）。然而，BSNF顯示出高出10倍的滑移性能（（圖3i）。BSNF上強(qiáng)大的滑移流也促使納米結(jié)構(gòu)內(nèi)出現(xiàn)強(qiáng)烈的渦流，渦度強(qiáng)度為4.0×10?3 s?1（BSNF）和2.2×10?3 s?1（PSNF）。值得注意的是，圖3j表明渦度強(qiáng)度預(yù)測(cè)了兩個(gè)捕獲測(cè)試的結(jié)果。此外，如果我們?cè)u(píng)估速度剖面在表面上的斜率，它與壁剪應(yīng)力成正比，我們還可以估計(jì)納米結(jié)構(gòu)的滑移質(zhì)量。BSNF 和 PSNF 的斜率 （~1） 比以前研究中提出的其他納米結(jié)構(gòu)（例如，大約 60）25 小得多，這可能是由于納米結(jié)構(gòu)包含具有最小固體分區(qū)的大空隙。

圖4：BSNFs芯片上病原體和NA富集/分離的評(píng)估

最后，我們執(zhí)行了粒子接近測(cè)試，以直接可視化BSNF上的滑移流（圖3k）。當(dāng)我們?cè)谕昝赖幕茥l件下以理想的無(wú)粘性流動(dòng)將溶液中的 10 μm 熒光顆粒推向垂直排列的固體表面時(shí)，流線(xiàn)（或粒子軌跡）顯示二維停滯流，在固體表面的中心有一個(gè)停滯點(diǎn)。雖然微尺度顆粒無(wú)法追蹤納米級(jí)多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)部或正上方的流體流動(dòng)，但它們可以定性地繪制流體流線(xiàn)和表面附近的邊界層，這將根據(jù)表面的滑移長(zhǎng)度和/或滲透率而改變。在這種情況下，裸PET上流速為零的防滑壁阻止了顆粒在膜附近流動(dòng)，從而導(dǎo)致停滯點(diǎn)和表面附近出現(xiàn)熒光空位。然而，BSNF憑借其增強(qiáng)的滑移流量，可以將該距離降低到22.5μm（~61%），這表明目標(biāo)可以更容易地接近并被BSNF捕獲。

BSNFs芯片的病原體和NA富集/分離評(píng)估

圖5：從BSNFs芯片中提取的SARS-CoV-2 RNA的高靈敏度PCR檢測(cè)

我們利用上述BSNF的增強(qiáng)捕獲效率，使用BSNF芯片進(jìn)行了富集和分離病原體和NA的實(shí)驗(yàn)。補(bǔ)充圖 10 直觀(guān)地描述了使用 BSNFs 芯片的病原體和 NA 富集/分離過(guò)程。在微通道內(nèi)，使用ADH捕獲帶負(fù)電荷的病原體和NA并將其富集在芯片表面，隨后使用高pH值（pH 10–11）洗脫緩沖液進(jìn)行分離（補(bǔ)充圖11）。通過(guò)采用ADH作為非離液性和同型雙官能團(tuán)的肼交聯(lián)劑，BSNFs芯片消除了對(duì)離液劑的需求，從而防止了NA降解。我們最初評(píng)估了樣品制備芯片定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）的病原體和NA富集效率，并將這些結(jié)果與使用常規(guī)NA分離方法獲得的結(jié)果進(jìn)行了比較。圖4a顯示了常規(guī)方法（無(wú)富集分離）、兩步法和一步法的示意圖概述。與傳統(tǒng)方法相比，兩步法顯示出更低的循環(huán)閾值 （Ct） 值，表明芯片有效地富集了病原體（圖 4b）。此外，采用樣品制備芯片的NA富集能力的1-Step方法顯示出比2-Step方法更低的Ct值。此外，在兩步法和一步法中，Ct值在Flat-、PSNFs-和BSNFs-芯片的順序上呈下降趨勢(shì)，這與表面結(jié)合效率的提高相關(guān)。值得注意的是，采用一步法的BSNFs芯片表現(xiàn)出卓越的捕獲效率和幾乎相同的絕對(duì)Ct值。

為了驗(yàn)證樣品制備芯片在NA檢測(cè)靈敏度方面的提高，我們?cè)u(píng)估了1-Step方法的LOD，使用HCT116細(xì)胞的連續(xù)稀釋液進(jìn)行細(xì)胞、基因組DNA和RNA富集，以及SARS-CoV-2培養(yǎng)液進(jìn)行病毒和病毒RNA富集。樣品制備芯片有效地將每個(gè)細(xì)胞和病毒樣品濃縮從 1 ml 濃縮到最終體積 100 μl。這些特征導(dǎo)致通過(guò)平芯片處理的所有樣品的 Ct 值較低，表明與傳統(tǒng)方法相比，平芯片的 LOD 降低了 10 倍（圖 4c-e）。此外，PSNFs和BSNFs芯片不僅通過(guò)納米結(jié)構(gòu)濃縮了病原體/NAs，而且富集了病原體/NAs，導(dǎo)致Ct值和LOD低于Flat-chip。這些差異可歸因于以下因素：DNA穩(wěn)健的雙螺旋結(jié)構(gòu)和RNA不穩(wěn)定的單鏈結(jié)構(gòu)之間的化學(xué)穩(wěn)定性不同，與帶正電荷的基團(tuán)的差異靜電偶聯(lián)，以及qRT-PCR中RNA所需的額外逆轉(zhuǎn)錄步驟。在芯片制造后，通過(guò)SEM成像和FT-IR光譜在2周內(nèi)確認(rèn)了BSNFs芯片的穩(wěn)定性。即使在用于病原體和 NA 富集/分離后，BSNFs-chip 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也得到了證實(shí)。這種魯棒性使BSNFs芯片適用于一次性和可重復(fù)使用的應(yīng)用。值得注意的是，該芯片在多次使用中表現(xiàn)出一致的性能，首次使用的 Ct 值為 27.78 ± 0.13，第二次使用的 Ct 值為 27.3 ± 0.35，第三次使用的 Ct 值為 27.03 ± 0.30，表明具有高重現(xiàn)性。這些結(jié)果進(jìn)一步確立了BSNFs芯片作為傳染病準(zhǔn)確診斷的有前途的樣品制備平臺(tái)的地位，凸顯了其作為傳染病靈敏和精確診斷的可靠工具的潛力。

對(duì)SARS-CoV-2患者和健康人的臨床樣本中的RNA進(jìn)行免PCR檢測(cè)

為了應(yīng)對(duì)SARS-CoV-2檢測(cè)的復(fù)雜性和耗時(shí)的qRT-PCR的挑戰(zhàn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種基于納米顆粒的LRET檢測(cè)方法，作為一種快速和簡(jiǎn)化的替代方案。該測(cè)定利用能量供體和受體之間距離依賴(lài)性非輻射能量轉(zhuǎn)移的原理，無(wú)需復(fù)雜的步驟即可進(jìn)行靶標(biāo)識(shí)別。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種將一步法樣品制備芯片和 LRET 檢測(cè)相結(jié)合的策略，從而將 SARS-CoV-2 診斷的樣本到答案時(shí)間從幾個(gè)小時(shí)大幅縮短到一小時(shí)以?xún)?nèi)。該策略首先使用 BSNFs 芯片富集/分離病原體和 NA，然后使用 LRET 測(cè)定鑒定富集的靶 RNA，從樣本收集到獲得 SARS-CoV-2 檢測(cè)結(jié)果的整個(gè)過(guò)程在 50 分鐘內(nèi)完成（圖 5a）。LRET系統(tǒng)由核/活性殼/殼鑭系元素?fù)诫s的納米顆粒和IRdye800組成。與靶位點(diǎn)互補(bǔ)的鏈?zhǔn)谴掏唬⊿）基因鏈的一部分，被分成兩個(gè)半序列，然后在LRET供體（18 bp DNA）和受體（20 bp DNA）的表面上進(jìn)行修飾。在 SARS-CoV-2 RNA 存在的情況下，互補(bǔ)對(duì)之間發(fā)生寡核苷酸雜交，使 LRET 供體和受體非常接近。該特性允許供體附近的受體在980 nm激發(fā)下通過(guò)LRET吸收供體的800 nm發(fā)射。相對(duì)強(qiáng)度隨著靶RNA濃度的增加而增加，其計(jì)算為L(zhǎng)RET供體的發(fā)光強(qiáng)度降低的比率。此外，LRET 供體和受體表面的 DNA 寡核苷酸可以特異性雜交到 SARS-CoV-2 RNA，與其他非靶標(biāo) NA 沒(méi)有明顯的交叉反應(yīng)性。我們使用 1 pM 其他常見(jiàn)傳染性呼吸道病毒的非靶序列驗(yàn)證了 LRET 測(cè)定的特異性。LRET 檢測(cè)成功將 SARS-CoV-2 與人類(lèi)冠狀病毒 OC43 、hCoV-NL63、hCoV-229E 和甲型流感病毒 （IAV） 區(qū)分開(kāi)來(lái)。

我們使用 10 倍連續(xù)稀釋的全長(zhǎng) SARS-CoV-2 基因組 RNA評(píng)估了 LRET 測(cè)定的分析靈敏度，范圍為 10?1 至 104 PFU。相對(duì)強(qiáng)度與SARS-CoV-2 RNA的對(duì)數(shù)濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，范圍為10-1至10-3 PFU，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.998（圖5c）。所有樣本的檢測(cè)結(jié)果均與陰性對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)推導(dǎo)的方程，LOD估計(jì)為10?0.93 PFU。加入 103 個(gè) PFU SARS-CoV-2 RNA 后，800 nm 發(fā)光壽命從 293 μs 猝滅到 265 μs，表明通過(guò)互補(bǔ)對(duì)之間的雜交，發(fā)生了從供體到受體的非輻射能量轉(zhuǎn)移56。最后，我們使用 30 個(gè)鼻咽 （NP） 拭子樣本測(cè)試了 LRET 測(cè)定與 BSNFs 芯片的臨床適用性。對(duì)于通過(guò)qRT-PCR確定為陽(yáng)性的患者樣本，LRET檢測(cè)與BSNFs芯片相結(jié)合也產(chǎn)生了陽(yáng)性結(jié)果，p值<0.0001。然而，LRET測(cè)定與常規(guī)提取方法相結(jié)合，產(chǎn)生了大量的假陰性結(jié)果（圖5d，e）。我們進(jìn)行了受試者操作員特征 （ROC） 分析以檢查診斷準(zhǔn)確性，其中使用 BSNFs-chip 的 LRET 測(cè)定成功區(qū)分了 SARS-CoV-2 陽(yáng)性和陰性樣本，靈敏度為 100.0%，ROC 曲線(xiàn)下面積 （AUC） 值為 1（圖 5f，g）。相比之下，LRET測(cè)定與常規(guī)方法相結(jié)合的靈敏度較低，為30.0%，AUC值為0.597。這些結(jié)果表明，通過(guò)將快速診斷系統(tǒng)與基于BSNFs芯片的樣品制備相結(jié)合，用于病原體/NA富集，具有無(wú)PCR檢測(cè)傳染病的潛力。

我們開(kāi)發(fā)了BSNFs芯片，這是一種具有雙孔納米結(jié)構(gòu)的樣品制備芯片，可協(xié)同增加表面積和表面滑移流的優(yōu)點(diǎn)。BSNFs芯片由成本低于1美元的PET薄膜制成，是一種具有成本效益的策略，封閉式系統(tǒng)降低了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。我們通過(guò)模擬和實(shí)驗(yàn)對(duì)潛在機(jī)制進(jìn)行了深入研究，證明了小孔隙和大孔隙在增加BSNFs表面積和滑移流方面的貢獻(xiàn)，甚至可以誘導(dǎo)納米渦旋，從而實(shí)現(xiàn)更好的NA隔離。基于通過(guò)模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的BSNFs芯片的高結(jié)合概率，我們?cè)u(píng)估了其使用基于PCR的方法富集病原體和NAs的有效性。與傳統(tǒng)提取方法相比，BSNFs芯片的LOD降低了100倍，這對(duì)于有效的傳染病檢測(cè)至關(guān)重要，尤其是在低病原體水平下。雖然單獨(dú)基于LRET的檢測(cè)的靈敏度低于基于PCR的方法，但一步法樣品富集系統(tǒng)和LRET檢測(cè)的集成可以成功區(qū)分SARS-CoV-2陽(yáng)性和陰性樣本，靈敏度為100.0%。我們的無(wú)PCR傳感方法將精心設(shè)計(jì)的樣品制備系統(tǒng)與檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，為高效、靈敏地診斷傳染病鋪平了道路。未來(lái)的研究將側(cè)重于通過(guò)探索膠束聚集機(jī)制和精確的孔隙控制來(lái)擴(kuò)展這些納米材料的適用性，包括設(shè)計(jì)定制的納米結(jié)構(gòu)，同時(shí)旨在加強(qiáng) BSNFs 芯片與 LRET 檢測(cè)的集成，以將其綜合效用從 SARS-CoV-2 檢測(cè)擴(kuò)展到更廣泛的病原體。我們預(yù)計(jì)，這種方法將在未來(lái)幾年內(nèi)在推進(jìn)傳染病快速靈敏診斷方法領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

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