藥物篩選是新藥研發(fā)的關(guān)鍵步驟,創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)需要采用適當(dāng)?shù)乃幬镒饔冒悬c(diǎn)對(duì)大量化合物樣品進(jìn)行篩選。高通量篩選系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)數(shù)千個(gè)反應(yīng)同時(shí)測(cè)試和分析,大大提高了藥物篩選的實(shí)驗(yàn)規(guī)模和效率。其中基于細(xì)胞水平的高通量藥物篩選系統(tǒng)因?yàn)楦咏咏梭w生理?xiàng)l件,成為主要的篩選模式。而目前發(fā)展成熟的高通量細(xì)胞篩選系統(tǒng)主要基于多孔板,存在細(xì)胞培養(yǎng)條件單一、耗時(shí)費(fèi)力、試劑消耗量大等問題,且較難實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的組合藥物篩選。微流控技術(shù)作為一種在微米尺度通道中操縱和控制微流體的技術(shù),具有微量、高效、高通量和自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn),能較好地克服多孔板篩選系統(tǒng)的不足,為構(gòu)建細(xì)胞高通量藥物篩選系統(tǒng)提供了一種高效、可靠的技術(shù)手段。微流控系統(tǒng)在細(xì)胞培養(yǎng)材料、芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和流體控制方面均可靈活變化,能更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境的調(diào)控和模擬。文章綜述了基于微流控技術(shù)的細(xì)胞水平高通量藥物篩選系統(tǒng)的研究進(jìn)展,按照不同的微流體操控模式,對(duì)基于灌注流、液滴和微陣列的3種類型的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)進(jìn)行了分類介紹,并分別總結(jié)了它們的優(yōu)缺點(diǎn),最后展望了微流控細(xì)胞水平高通量藥物篩選系統(tǒng)的發(fā)展前景,提出了該領(lǐng)域目前存在的問題以及解決問題的方向。

藥物篩選是指從天然產(chǎn)物或者人工合成的化合物中篩選出具有生物活性的新藥或者先導(dǎo)化合物,是新藥研發(fā)過程中的關(guān)鍵步驟。創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)需要采用適當(dāng)?shù)乃幬镒饔冒悬c(diǎn)對(duì)大量化合物樣品進(jìn)行篩選。而隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、組合化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,藥物分子庫(kù)在不斷擴(kuò)大,藥物作用靶點(diǎn)也越來越多,這使得藥物發(fā)現(xiàn)的范圍逐漸擴(kuò)大,藥物篩選的工作量急劇增加。因此高通量篩選(high-throughput screening)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。高通量篩選系統(tǒng)以分子水平或細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ),通過自動(dòng)化操作系統(tǒng)、靈敏快速的檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)數(shù)千個(gè)反應(yīng)同時(shí)測(cè)試和分析,大大提高了藥物篩選的實(shí)驗(yàn)規(guī)模和效率?；诩?xì)胞水平的藥物篩選系統(tǒng)因?yàn)楦咏咏梭w生理?xiàng)l件,實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確率更高,成為主要的篩選模型。

目前已經(jīng)發(fā)展成熟的細(xì)胞高通量篩選系統(tǒng)主要是基于多孔板進(jìn)行的。它們利用自動(dòng)化的液體轉(zhuǎn)移分配機(jī)械臂完成對(duì)液體的多步操控和試劑運(yùn)輸,并使用多孔板掃描儀或者自動(dòng)化顯微鏡掃描拍攝技術(shù)對(duì)細(xì)胞的生存情況進(jìn)行檢測(cè)。但是這些自動(dòng)化設(shè)備的價(jià)格相對(duì)較高,不利于普通小型的研究中心或?qū)嶒?yàn)室使用。另外,用于藥物篩選的生物樣品和藥物庫(kù)的成本也較高,而目前常規(guī)液體處理設(shè)備能夠準(zhǔn)確操控的液體體積在數(shù)百納升水平。

微流控技術(shù)是近年來的研究熱點(diǎn)之一,其核心是將常規(guī)化學(xué)、生物等領(lǐng)域所涉及的基本操作單元集成到方寸大小的芯片上,實(shí)現(xiàn)對(duì)nL級(jí)至pL級(jí)液體的精準(zhǔn)操控,在化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用。利用微流控技術(shù)可以構(gòu)建高通量、低成本細(xì)胞水平的藥物篩選系統(tǒng),系統(tǒng)具有樣品及試劑消耗量少、系統(tǒng)高度集成化和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí),微流控芯片與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)器皿相比,在細(xì)胞培養(yǎng)上也具有諸多優(yōu)勢(shì)。如通過選擇不同的芯片材料或者設(shè)計(jì)不同的細(xì)胞培養(yǎng)腔室結(jié)構(gòu),更容易實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維(3D)培養(yǎng)。因此,基于微流控技術(shù)的細(xì)胞篩選系統(tǒng)是一種極具潛力的藥物篩選系統(tǒng)。

在微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)中,通常會(huì)涉及細(xì)胞的接種、培養(yǎng)液的更換或添加、藥物的加入與清洗、細(xì)胞染色試劑的添加等操作,這些操作均需通過對(duì)微流體的操控得以實(shí)現(xiàn)。按照微流體操控模式的不同,可將微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)分為3類,分別是灌注流模式、液滴模式和微陣列模式。

基于灌注流模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)

基于灌注流模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng),通過控制流體連續(xù)流過微通道,將細(xì)胞接種在微通道中的細(xì)胞培養(yǎng)腔室,并完成對(duì)細(xì)胞的藥物刺激。流體的驅(qū)動(dòng)力主要有外部機(jī)械泵驅(qū)動(dòng)、電滲驅(qū)動(dòng)、重力驅(qū)動(dòng)以及表面張力驅(qū)動(dòng)等方式。這類系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于容易實(shí)施,并適用于不同的細(xì)胞檢測(cè)方法,如熒光檢測(cè)、吸光度檢測(cè)、電化學(xué)傳感器實(shí)時(shí)檢測(cè),以及通過質(zhì)譜對(duì)細(xì)胞代謝物或其他生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。這類系統(tǒng)的局限性主要有:利用微通道進(jìn)行連續(xù)流體輸送易導(dǎo)致較高的試劑消耗;當(dāng)被應(yīng)用于大規(guī)模的藥物篩選時(shí),芯片結(jié)構(gòu)通常比較復(fù)雜,涉及多種通道、液體控制泵和閥門的設(shè)計(jì)。

Wang等設(shè)計(jì)了一種基于灌注流模式的微流控芯片,用于正交化的藥物篩選(見圖1a)。芯片在水平和垂直兩個(gè)方向上分別加工有24條通道,通過在芯片中集成氣動(dòng)彈性微閥實(shí)現(xiàn)對(duì)垂直通道和水平通道的分別控制,完成不同類型的細(xì)胞接種和不同藥物對(duì)不同細(xì)胞的正交化刺激。利用該芯片測(cè)試了洋地黃皂苷(digitonin)、皂角苷(saponin)、丙烯醛(acrolein)、氯化鈷(CoCl2)和氯化鎳(NiCl2)5種物質(zhì)分別對(duì)于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(BALB/3T3)、HeLa細(xì)胞和牛內(nèi)皮細(xì)胞(bovine endothelial cells)的毒性作用,實(shí)現(xiàn)了高密度平行的藥物篩選。Park等在類似的芯片結(jié)構(gòu)上設(shè)計(jì)了橋連式的微通道來輸送細(xì)胞和藥物(見圖1b),研究了細(xì)胞外基質(zhì)與可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1對(duì)二型肺泡上皮細(xì)胞(ATII)表型的影響。這種方法不僅可以提高對(duì)目標(biāo)細(xì)胞腔室尋址的靈活性,還能減少流體剪切力對(duì)細(xì)胞的影響。

圖 1   基于灌注流模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)

顯著的層流效應(yīng)是灌注流體系的主要特征之一,利用該效應(yīng)可以在微通道內(nèi)形成具有較高重現(xiàn)性和穩(wěn)定性濃度梯度的液流,這類系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞高通量藥物篩選中。Ye等將濃度梯度藥物形成與細(xì)胞培養(yǎng)這兩個(gè)單元集成到一個(gè)圓盤芯片中(見圖1c)。該芯片含8個(gè)具有相同結(jié)構(gòu)的單元,每個(gè)單元在上游包含一個(gè)“圣誕樹”結(jié)構(gòu)的濃度梯度生成器,下游平行連接多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)腔室,單次可產(chǎn)生64種藥物作用條件,實(shí)現(xiàn)了對(duì)阿霉素(doxorubicin)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞(HepG2)凋亡過程的監(jiān)測(cè)。An等將兩個(gè)相似結(jié)構(gòu)的濃度梯度生成器與細(xì)胞培養(yǎng)腔室正交連接,評(píng)估了姜黃素(curcumin)和腫瘤壞死因子-α相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體對(duì)前列腺癌細(xì)胞(PC3)的聯(lián)合治療效果。

為了擴(kuò)大藥物濃度梯度范圍,Zhang等設(shè)計(jì)了一種非對(duì)稱流體通道結(jié)構(gòu)的濃度梯度生成器,用于生成具有對(duì)數(shù)級(jí)濃度混合比的藥物組合。3D打印技術(shù)由于能夠制造結(jié)構(gòu)復(fù)雜且相互連接的微流體通道,因而被用來加工用于溶液混合的微流控芯片。Chen等利用3D打印得到了具有三維立體螺旋結(jié)構(gòu)的濃度梯度生成器(見圖1d),并測(cè)試了4種藥物的36種濃度組合對(duì)肺癌細(xì)胞(A549)的抑制作用。

基于微通道表面的二維(2D)細(xì)胞培養(yǎng)模式缺乏細(xì)胞生長(zhǎng)分化所需的多層次微環(huán)境,例如細(xì)胞和細(xì)胞之間以及細(xì)胞和基質(zhì)之間的相互作用,這可能會(huì)導(dǎo)致篩選得到的藥物在被應(yīng)用到臨床試驗(yàn)時(shí),治療效果產(chǎn)生較大偏差。3D細(xì)胞培養(yǎng)模式因?yàn)榭梢蕴峁└咏咏w內(nèi)條件的微環(huán)境,而吸引了越來越多研究人員的關(guān)注。如圖2a所示,Patra等通過對(duì)聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片進(jìn)行預(yù)處理,使細(xì)胞不能貼壁生長(zhǎng),從而在腔室中形成細(xì)胞球并進(jìn)行藥物刺激。該研究組研究了順鉑(cisplatin)、白藜蘆醇(resveratrol)和替拉扎明(tirapazamine)3種藥物對(duì)不同大小的HepG2細(xì)胞球的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)胞球的大小和細(xì)胞的培養(yǎng)模式(2D和3D)對(duì)藥物刺激結(jié)果均有明顯的影響。Toh等報(bào)道了一種基于3D肝細(xì)胞培養(yǎng)的微流控芯片系統(tǒng)(見圖2b)。通過在芯片的通道中央加工兩排并列的微柱陣列來固定肝細(xì)胞,維持肝細(xì)胞的3D形態(tài)和代謝功能,之后由兩側(cè)平行通道引入不同的藥物刺激肝細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞的高通量藥物毒性測(cè)試。Mulholland等發(fā)展了一種微流控平臺(tái),該平臺(tái)直接利用腫瘤活檢中獲得的富含癌細(xì)胞的多細(xì)胞球體進(jìn)行藥物篩選,能夠提高篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。Pandya等將電化學(xué)傳感器集成到微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)中,通過叉指微電極實(shí)時(shí)檢測(cè)3D凝膠基質(zhì)中植入的癌細(xì)胞對(duì)不同藥物的敏感性(見圖2c)。這些數(shù)據(jù)可以潛在地預(yù)測(cè)患者對(duì)于不同化療方法的反應(yīng),從而選擇出最佳治療手段,改善癌癥治療效果。

圖 2   基于3D細(xì)胞培養(yǎng)的灌注流模式微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)

隨著微流控技術(shù)的不斷發(fā)展,多種能夠用于模擬人體不同器官及組織間相互作用的器官芯片(organ-on-a-chip)系統(tǒng)已經(jīng)被報(bào)道,包括肺芯片、腎芯片、腦芯片和腸-肝-腫瘤芯片等。這些器官芯片系統(tǒng)大部分是基于灌注流模式構(gòu)建。Huh等構(gòu)建了一種具有一定仿生功能的肺芯片(見圖3a)。該芯片中,在上下兩個(gè)PDMS通道之間加工有PDMS多孔膜,PDMS多孔膜上下兩側(cè)分別接種肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,肺泡上皮細(xì)胞暴露在空氣中模擬肺泡的空隙,培養(yǎng)基從下方通道注入模擬毛細(xì)血管,通過循環(huán)施加真空帶動(dòng)膜的往復(fù)運(yùn)動(dòng)模擬肺的呼吸。該研究組將白細(xì)胞介素-2(interleukin-2)添加到培養(yǎng)基中,再現(xiàn)了其導(dǎo)致肺水腫的藥物毒性,并觀察到血管生成素-1(angiopoietin-1)以及一種新的香草酸受體4的離子通道抑制劑(GSK2193874)能抑制其藥物毒性。Liu等設(shè)計(jì)了一種微通道芯片用于模擬腫瘤誘導(dǎo)的血管生成(見圖3b)。芯片包含6個(gè)獨(dú)立的血管生成單元,每個(gè)單元由一個(gè)開放式的細(xì)胞培養(yǎng)腔室和腔室兩側(cè)的血管生成通道組成。通過觀察內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)下的遷移和血管生成過程,研究了不同的抗血管生成試劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用。Oleaga等構(gòu)建了一種包含心臟、肌肉、神經(jīng)元和肝臟細(xì)胞的多器官芯片(見圖3c)。通過重力驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)基在不同細(xì)胞腔室之間循環(huán)流動(dòng),實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)和藥物刺激過程。在芯片上測(cè)試了5種藥物的細(xì)胞毒性,得到的結(jié)果與已被公布的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)毒性結(jié)果基本一致。

圖 3   基于灌注流模式的器官芯片系統(tǒng)

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