1.2 物理特性富集法

物理特性富集法根據(jù)物理性質(zhì)來分離CTC，包括大小、密度、力學(xué)和介電性質(zhì)。從大小上來看，CTC的直徑約為10-20μm，而血細(xì)胞大小為7-12μm，通過過濾可留下體積較大的CTC。從密度上來看，CTC的密度較白細(xì)胞和紅細(xì)胞密度小，通過密度梯度離心可實現(xiàn)CTC分離。除了大小和密度的差異，一些技術(shù)也利用CTC和血細(xì)胞之間的力學(xué)和介電性質(zhì)差異來捕獲CTC。具體來說，CTC的可變形性不及血細(xì)胞。另外，CTC的膜電容通常較血細(xì)胞低，在一定強度的電場中，其遷移率與血細(xì)胞會產(chǎn)生差異。微流控技術(shù)除了在親和性富集法中有廣泛應(yīng)用外，在物理特性富集法中也有應(yīng)用。微流控芯片根據(jù)CTC與血細(xì)胞物理特性的差異，通過在芯片中設(shè)置不同的微結(jié)構(gòu)單元將其從血液中分離出來，常用的微結(jié)構(gòu)包括微孔、微過濾網(wǎng)和微柱等。

1.3 生化和物理特性相結(jié)合的方法

此外，也有一些技術(shù)將CTC的物理和生物化學(xué)特性結(jié)合起來用于CTC富集。如CTC-iChip，其基于CTC大小和表面標(biāo)志物的表達(dá)情況進(jìn)行CTC富集。該技術(shù)首先根據(jù)細(xì)胞大小，將較小的紅細(xì)胞和血小板過濾出去，留下白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。然后，用識別EpCAM的磁珠偶聯(lián)抗體對CTC進(jìn)行免疫染色，在磁場中捕獲并收集在芯片上。或者用識別CD45的磁珠偶聯(lián)抗體去除白細(xì)胞后收集CTC。

生化和物理特性相結(jié)合的富集法（以CTC-iChip為例）

二CTC富集技術(shù)的發(fā)展歷程和趨勢

2.1 發(fā)展歷程

從技術(shù)發(fā)展史來看，CTC富集技術(shù)分為三代：第一代為基于物理特性的粗分離技術(shù)，第二代為基于生化特性的免疫磁珠技術(shù)，第三代為基于物理或生化特性的微流控芯片技術(shù)。

2.1.1 基于物理特性的粗分離技術(shù)

基于物理特性的粗分離技術(shù)通過特殊濾膜裝置、密度梯度離心將CTC分離出來。這些技術(shù)操作簡單成本低廉，不依賴細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，捕獲的細(xì)胞數(shù)量多，但是由于CTC物理特性的異質(zhì)性，難以富集到高純度的CTC。

基于物理特性的粗分離技術(shù)

2.1.2 基于生化特性的免疫磁珠技術(shù)

基于生化特性的免疫磁珠技術(shù)通過免疫磁珠偶聯(lián)的抗體或多肽正向或負(fù)向篩選出CTC。由于技術(shù)的限制，早期的磁珠只能達(dá)到微米級。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在使用的磁珠大都為納米級，其增大的比表面積增加了與待測細(xì)胞的接觸幾率，更好的分散性降低了對細(xì)胞造成的機械性壓力，大大提高了CTC的富集率。最典型的基于免疫磁珠富集CTC的技術(shù)平臺是強生子公司veridex的CellSearch，其是全球目前唯一同時經(jīng)過FDA和CFDA批準(zhǔn)的用于CTC檢測的商業(yè)化產(chǎn)品。該產(chǎn)品由于檢測靈敏度不高，且無法分離活體CTC，2016年初已停產(chǎn)。除了CellSearch之外，也有多種技術(shù)平臺基于免疫磁珠技術(shù)捕獲CTC，如AdnaGen公司（已被Qiagen收購）的AdnaTest，Miltenyi公司的MACS，Illumina公司的MagSweeper。

用于CTC檢測的CellSearch平臺。（A）將血液吸入含有EDTA和細(xì)胞保護(hù)劑的CellSave保護(hù)管中;（B）將7.5mL血液轉(zhuǎn)移到單獨的管中并離心以分離固體血液成分和血漿;（C）樣品放入CELLTRACKS?AUTOPREP? 系統(tǒng)中，吸出血漿并將樣品重懸于緩沖液中;（D）添加偶聯(lián)EpCAM抗體的磁性納米顆粒并與EpCAM陽性細(xì)胞結(jié)合，從而“富集”上皮來源的CTC。然后將磁珠結(jié)合的細(xì)胞與其他細(xì)胞通過磁性分離;（E）CTC用CK8，CK18和CK19抗體染色。CD45陽性染色細(xì)胞被認(rèn)為是白細(xì)胞，并被排除在分析之外;（F）應(yīng)用DAPI染色細(xì)胞核;（G）施加磁力以分離磁珠結(jié)合的EpCAM陽性細(xì)胞;（H）CK陽性、DAPI陽性、CD45陰性的細(xì)胞被認(rèn)為是CTC用于進(jìn)一步分析。

2.1.3 微流控芯片技術(shù)

微流控芯片技術(shù)基于CTC的物理特性或生化特性或兩種特性的結(jié)合來富集CTC，所需樣品量小、流速可控而且能夠捕獲活細(xì)胞。微流控芯片技術(shù)目前已經(jīng)歷了三代的發(fā)展過程：第一代芯片為以CTC-Chip為代表，第二代芯片以HB-Chip為代表，第三代芯片以CTC-iChip為代表。

微流微柱富集：該類芯片基于CTC與血細(xì)胞生化特性的差異，在芯片中設(shè)置微柱陣列將其從血液中分離出來。此類芯片以CTC-Chip為代表，該芯片是第一個使用微流體技術(shù)富集CTC的裝置。CTC-Chip由78,000個微柱陣列組成，微柱被識別EpCAM的抗體包被，微柱的幾何排列和流體流速被優(yōu)化以促進(jìn)細(xì)胞附著到抗體包被的柱上。除了CTC-Chip，也有一些公司開發(fā)基于微柱結(jié)構(gòu)的芯片富集CTC，如Captura公司的GEDI-Chip，Biocept公司的OncoCEE?；谖⒅Y(jié)構(gòu)的芯片由于復(fù)雜的微柱設(shè)計很難在大規(guī)模的基礎(chǔ)上進(jìn)行高通量生產(chǎn)。此外，目前用于CTC檢測和表征的技術(shù)嚴(yán)重依賴于免疫細(xì)胞化學(xué)和需要高分辨率成像的其他技術(shù)，這在非透明三維微柱陣列的存在下是困難的。

第一代芯片CTC-Chip

微流表面富集：由于基于微柱結(jié)構(gòu)的芯片的局限性，表面捕獲的微流體芯片被開發(fā)，這些芯片使用抗體包被的表面裝置捕獲CTC。表面捕獲裝置的簡化架構(gòu)更適合于大規(guī)模生產(chǎn)，并且還允許制造更易于成像的透明裝置。此類芯片以HB-Chip為代表，其微流道的結(jié)構(gòu)為魚骨形（HB），表面被識別EpCAM的抗體包被，血液流過一個可視通道，通道內(nèi)魚骨形溝回能夠引起血液的一個輕微斡旋，從而增強了其與抗體修飾表面的接觸。與第一代CTC芯片相比，第二代的HB芯片制作更為簡單，且可更高效地捕獲腫瘤細(xì)胞，捕獲效率約90%。后人在第二代的基礎(chǔ)上加上了aptamer（結(jié)合CTC表面的EpCAM），進(jìn)一步提高了CTC的捕獲效率。除了HB-Chip，GEM-Chip、GO-Chip以及BioFluidica公司的ModularSinusoidal Microsystem也都采用表面裝置捕獲CTC。使用表面捕獲裝置的一個挑戰(zhàn)是下游處理的靈活性，捕獲的CTC被固定在裝置的表面上，并且難以恢復(fù)以進(jìn)行進(jìn)一步分析。在胰蛋白酶消化后可以釋放在這些裝置中捕獲的細(xì)胞，然而胰蛋白酶很可能切割用于后續(xù)分析的許多感興趣的表面受體。

第二代芯片HB-Chip

微流免疫磁珠富集：目前已經(jīng)有多家公司或研究單位應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)來解決表面捕獲裝置的局限性，該技術(shù)能很好地控制細(xì)胞捕獲與釋放。此類芯片以CTC-iChip為代表，該芯片將免疫磁珠和微流控技術(shù)結(jié)合起來用于CTC富集。CTC-iChip首先使用塑料微柱陣列將小個的紅細(xì)胞和血小板過濾出去，然后在磁場中通過“慣性聚焦”作用將較大的細(xì)胞排成一行，并使用陽性或陰性富集方法分離CTC與白細(xì)胞。CTC-iChip的捕獲效率可以高達(dá)98%，但是對于直徑較?。?lt;8微米）的CTC并不適用。除了CTC-iChip，也有多種芯片技術(shù)使用免疫磁珠富集CTC。如Ephesia公司的Ephesia，Cynvenio公司的LiquidBiopsy，F(xiàn)luxion公司的Isoflux，這些芯片的捕獲效率與第二代芯片相近，為90%左右。

上述芯片主要基于CTC的生化特性將其從血液中分離出來，具有特異性高的優(yōu)點，能有效分選形狀、大小相似的不同種類細(xì)胞。目前大部分技術(shù)采用EpCAM作為CTC的表面特異性抗原，但是在不同的腫瘤亞型中，EpCAM的表達(dá)各不相同。依賴EpCAM的CTC分選芯片會丟失不表達(dá)或低表達(dá)EpCAM的CTC，然而這些CTC具有更大的浸潤性和侵入性。因此，缺乏公認(rèn)的表面標(biāo)志物限制了親和性富集在CTC分選中的應(yīng)用。

為了無需依賴表面標(biāo)志物，也有一些微流控芯片基于物理特性富集CTC，目前主要有基于細(xì)胞大小和變形性差異的芯片技術(shù)，基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的芯片技術(shù)和基于細(xì)胞介電性質(zhì)的雙向電泳技術(shù)。

基于細(xì)胞大小和變形性差異的芯片技術(shù)：該技術(shù)通過在芯片內(nèi)部設(shè)計不同的小于CTC直徑的微孔、微過濾網(wǎng)、微柱等結(jié)構(gòu)，當(dāng)含有CTC的樣品流經(jīng)芯片時，CTC由于直徑大而被卡在結(jié)構(gòu)內(nèi)，血細(xì)胞則隨緩沖液一起流出，較大的白細(xì)胞被結(jié)構(gòu)捕獲時，由于CTC比白細(xì)胞變形性小，加大緩沖液流速時，白細(xì)胞被沖走，CTC則留在芯片內(nèi)，從而達(dá)到分離目的。Abnova公司的ClearCell?CXSystem就是基于此原理分離CTC的代表，該系統(tǒng)還可以動態(tài)監(jiān)測CTC的捕獲過程。芯片主要結(jié)構(gòu)由圓柱形微柱構(gòu)成，每個捕獲單元由三個圓柱排列組成一個“爪形”結(jié)構(gòu)。

基于細(xì)胞大小和變形性差異分選CTC的優(yōu)勢在于：操作過程簡單，捕獲效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量富集，成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CellSearch，無需依賴表面標(biāo)志物，分選出的CTC可以用多種抗體進(jìn)行標(biāo)志物鑒別。該方法存在的問題是僅僅基于細(xì)胞尺寸和變形性不同而進(jìn)行過濾式分選，由于CTC尺寸和白細(xì)胞有重疊部分，CTC有可能會通過濾網(wǎng)或微柱的間隔；而且在較大的機械力作用下，CTC隨著緩沖液流過微柱或者濾網(wǎng)時容易破裂。這些因素會對分離純度和細(xì)胞活性造成一定影響，這類芯片在設(shè)計內(nèi)部捕獲單元時應(yīng)避免使用帶棱角的微柱，比如三角形、長方形、正方形等。

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