細(xì)胞培養(yǎng)包括在人工環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞，以研究它們對環(huán)境的反應(yīng)行為?，F(xiàn)在可以找到不同種類的細(xì)胞培養(yǎng)物，根據(jù)其性質(zhì)和應(yīng)用，其中一些會比另一些更適合。其中，與其他替代細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，3D細(xì)胞培養(yǎng)因其新的、方便的特點(diǎn)而越來越多地被使用。3D細(xì)胞培養(yǎng)可以被描述為在微組裝設(shè)備和載體中培養(yǎng)活細(xì)胞，呈現(xiàn)出模仿組織和器官特定微結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)。

掃描電子顯微鏡二維細(xì)胞培養(yǎng)圖像

 1. 培養(yǎng)方法：2D VS 3D

1.1.2D培養(yǎng)速覽

在過去的幾十年里，2D培養(yǎng)傳統(tǒng)上不僅被用于研究不同類型的體外細(xì)胞，還被用于進(jìn)行藥物篩選和測試。通常，這種單層系統(tǒng)允許細(xì)胞在聚酯或玻璃平面上生長，為不斷增長的細(xì)胞群提供了一種介質(zhì)。由于2D細(xì)胞培養(yǎng)，出現(xiàn)了無數(shù)的生物學(xué)突破。然而，由于其簡單性，該模型不能準(zhǔn)確地描述和模擬體內(nèi)觀察到的豐富的環(huán)境和復(fù)雜的過程，如細(xì)胞信號、化學(xué)或幾何。因此，用2D細(xì)胞培養(yǎng)方法收集的數(shù)據(jù)對于體內(nèi)應(yīng)用可能是誤導(dǎo)和不可預(yù)測的。
這就是為什么科學(xué)家們最近一直在研究三維仿生細(xì)胞培養(yǎng)，這項(xiàng)技術(shù)更準(zhǔn)確地代表了細(xì)胞在體內(nèi)茁壯成長的實(shí)際微環(huán)境。

1.2.3D細(xì)胞培養(yǎng)：比較3D細(xì)胞培養(yǎng)與2D細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)

你可能已經(jīng)知道，3D細(xì)胞培養(yǎng)有不同的類型，每一種都有不同的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。與2D細(xì)胞培養(yǎng)不同，3D細(xì)胞培養(yǎng)通過使用微組裝結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的環(huán)境參數(shù)來促進(jìn)細(xì)胞分化和組織形成。事實(shí)上，與在2D環(huán)境中生長的細(xì)胞相反，在3D環(huán)境中，細(xì)胞往往更容易受到形態(tài)和生理變化的影響。這主要可以通過指導(dǎo)細(xì)胞行為的支架的結(jié)構(gòu)作用和影響來解釋。研究人員發(fā)現(xiàn)，這種細(xì)胞載體的幾何形狀和組成不僅可以影響基因的表達(dá)，還可以增強(qiáng)細(xì)胞間的溝通。例如，一些促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因在3D細(xì)胞培養(yǎng)中被抑制，從而避免了2D細(xì)胞培養(yǎng)中遇到的無政府增殖。
3D細(xì)胞培養(yǎng)還提供了同時培養(yǎng)兩個不同細(xì)胞群體的可能性，與基于2D細(xì)胞培養(yǎng)的共培養(yǎng)不同，共培養(yǎng)準(zhǔn)確地復(fù)制了組織內(nèi)觀察到的細(xì)胞功能。感興趣的細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的相互作用顯然是細(xì)胞功能的關(guān)鍵要素。這就是為什么對基質(zhì)細(xì)胞(器官結(jié)締組織)進(jìn)行研究的原因，基質(zhì)細(xì)胞在癌癥中發(fā)揮重要作用。最后，使用3D細(xì)胞培養(yǎng)可以更容易地控制和監(jiān)測生長細(xì)胞的微環(huán)境參數(shù)(溫度、化學(xué)梯度、氧氣速率、pH等)。在一定程度上，同時盡可能接近現(xiàn)實(shí)，這要?dú)w功于微工程(微流體)。

3D細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的新生視網(wǎng)膜
人們必須記住，3D細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)相對較新的技術(shù)，研究人員尚未完全掌握其潛在的現(xiàn)象和含義。不幸的是，這種培養(yǎng)方法帶來了一些明顯的缺點(diǎn)，很可能被技術(shù)進(jìn)步所克服。首先，一些支架基質(zhì)含有來自動物或其他有害來源(病毒、可溶性因子)的化合物，可能會干擾細(xì)胞培養(yǎng)。其他一些基質(zhì)提供了良好的細(xì)胞粘附性，使得去除細(xì)胞變得更加困難。此外，雖然3D細(xì)胞培養(yǎng)可能是一種節(jié)省成本的技術(shù)，可以跳過藥物試驗(yàn)中的動物藥物測試步驟，但開發(fā)自動化和可重復(fù)應(yīng)用仍然是一個非常昂貴和細(xì)致的過程。

【與2D單層細(xì)胞培養(yǎng)不同，3D細(xì)胞培養(yǎng)是模擬體內(nèi)細(xì)胞行為和組織(形態(tài)和生理)的更令人滿意的模型。組裝多層三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)只能通過使用支架來實(shí)現(xiàn)，支架是一種微組織的細(xì)胞載體，對細(xì)胞的分化和增殖有很大影響。由于它的新穎性，這項(xiàng)技術(shù)還沒有完全被理解，因此不容易掌握。最后，為改進(jìn)3D細(xì)胞培養(yǎng)而進(jìn)行的應(yīng)用程序開發(fā)可能代價高昂。】

2.3D培養(yǎng)中的支架類型

【支架是3D細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵支撐元素，根據(jù)條件和預(yù)期的目標(biāo)，目前有不同類型的支架可供選擇。】

2.1.基于支架的3D培養(yǎng)技術(shù)

如上所述，支架可以為3D細(xì)胞培養(yǎng)提供方便的支撐。由于其多孔性，支架有助于氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和廢物的運(yùn)輸。因此，細(xì)胞可以在支架網(wǎng)內(nèi)增殖和遷移，最終附著在支架網(wǎng)上。隨著它們的不斷生長，成熟的細(xì)胞最終會相互作用，最終會變成與它們最初起源的組織接近的結(jié)構(gòu)。大多數(shù)情況下，這些聚集體呈現(xiàn)為不同大小的球體，稱為球體：這種細(xì)胞結(jié)構(gòu)通常用于藥物篩選和任何其他3D細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用。最后，使用支架的3D細(xì)胞培養(yǎng)提供了更大的表面，通常比那些不依賴這種支架的細(xì)胞培養(yǎng)更大。

隨機(jī)組織的腳手架結(jié)構(gòu)的示例

2.1.3其他類型的腳手架

如前所述，除了水凝膠，還有一些其他類型的支架可以找到，盡管絕大多數(shù)都是作為組織工程支架使用的。其中一種材料，生物玻璃或生物陶瓷，是一種可生物吸收的材料，可以提高新生組織的再生活性。另一方面，由于金屬具有較高的抗壓強(qiáng)度，尤其是優(yōu)異的抗疲勞性，設(shè)計(jì)了主要由鈦(Ti)和鉭(Ta)制成的多孔金屬支架。
常用的非凝膠聚合物支架是用于組織工程的天然聚合物，如膠原、纖維蛋白、海藻酸鹽、絲綢、透明質(zhì)酸和殼聚糖。合成聚合物有聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚己內(nèi)酯(PCL)。這些聚合物被優(yōu)先使用，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生的單體在植入時很容易被自然生理途徑移除。最后，復(fù)合材料也用于搭建腳手架。它們由兩種或兩種以上截然不同的材料(例如陶瓷和聚合物的組合)組成，以利用這兩種材料的性能來滿足機(jī)械和生理要求。

一種復(fù)合支架的制備工藝及微觀觀察

2.2.無支架三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

為了產(chǎn)生球體，細(xì)胞聚集體作為良好的生理模型，也可以制作不依賴固體支持(ECM分子或生物材料)的3D培養(yǎng)。使用這種技術(shù)獲得的球體大多更小，阻力更小。無支架三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要有強(qiáng)制漂浮法、懸滴法和攪拌法。
無腳手架技術(shù)包括使用低附著力聚合物涂層井板的強(qiáng)制漂浮法。球體是在離心后用細(xì)胞懸浮液填充這些孔板而產(chǎn)生的。
懸滴法是Kelm等人采用的一種無支架技術(shù)，包括將細(xì)胞懸浮液等量放置在微孔微型托盤(Nunc)內(nèi)。通過反轉(zhuǎn)盤子(托盤)，等分變成液滴，在其尖端呈現(xiàn)細(xì)胞聚集體，從而形成致密而均勻的球體。
最后但并非最不重要的是，使用生物反應(yīng)器的基于攪拌的方法也可以是獲得三維球體的一種簡單的替代方法。放置在旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中的細(xì)胞懸浮液逐漸將分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂w，由于持續(xù)的攪拌，這些聚集體無法附著在容器壁上。結(jié)果，最終產(chǎn)生了范圍廣泛的非均勻橢球體。

無支架三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

【支架是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增強(qiáng)信號的多孔性支撐物。為了達(dá)到這一目的，它們促進(jìn)了氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、可溶性因子和廢物的運(yùn)輸，這要?dú)w功于它們旨在模擬體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。目前制作的支架是膜、基質(zhì)，最重要的是具有優(yōu)異性能的水凝膠。用于組織工程的支架不同于那些在3D細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的支架，因?yàn)樗哂歇?dú)特的特征，如生物降解性。最后，還可以使用無支架3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來獲得球體：強(qiáng)制漂浮法、懸滴法和攪拌法。】

3.3D培養(yǎng)中的細(xì)胞特性

【無論它們來自哪里，在3D細(xì)胞培養(yǎng)中生長的細(xì)胞都會呈現(xiàn)出特殊的外觀，這取決于它們要模擬的組織。它們呈現(xiàn)不同的屬性和交互作用，如下所述。】

3.1.3D培養(yǎng)：細(xì)胞大體形態(tài)

與2D細(xì)胞培養(yǎng)呈現(xiàn)單層結(jié)構(gòu)相反，三維方法產(chǎn)生多層細(xì)胞聚集體(球體)，呈現(xiàn)類似于體內(nèi)觀察到的復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)。正如上一部分所解釋的，這一壯舉主要是由于支架的構(gòu)建作用，使細(xì)胞能夠獲得這樣的組織樣組織。最后，總體外觀最終將取決于細(xì)胞類型，因?yàn)樵?D培養(yǎng)中生長的上皮組織往往會形成極化的薄片，就像皮膚表皮一樣。

3.2.3D培養(yǎng)：細(xì)胞間的相互作用

細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用都是3D細(xì)胞培養(yǎng)中需要考慮的關(guān)鍵參數(shù)。通過直接接觸或化學(xué)作用，細(xì)胞可以相互作用并協(xié)同作用，以實(shí)現(xiàn)特定的目的。

首先，通信是通過細(xì)胞連接實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞連接是由蛋白質(zhì)組成的直接細(xì)胞間通道，形成了連接一個細(xì)胞與其鄰居(或一個細(xì)胞與基質(zhì))的通道。此外，細(xì)胞因子或生長因子等分泌的可溶性因子通過直接接觸或流動輸送到鄰近細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，產(chǎn)生由分子壽命決定的梯度。這些因子最終會與任何其他細(xì)胞(或用于自動調(diào)節(jié)的同一細(xì)胞)表達(dá)的受體結(jié)合，從而觸發(fā)生理反應(yīng)。此外，流向ECM的分子將由載體儲存，并在需要時釋放

細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用

此外，細(xì)胞還可以蓬勃發(fā)展，這要?dú)w功于分化和生理功能所必需的細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用(為了更好地表達(dá)生物標(biāo)志物和受體)。這種相互作用是至關(guān)重要的，因?yàn)樯L細(xì)胞獲得的一些特性只能通過支架對基因表達(dá)的影響及其對整個組織組織的支持作用來獲得

3.3用于3D細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞的來源和性質(zhì)

廣泛的細(xì)胞類型可以被取樣作為底物，以在3D培養(yǎng)中產(chǎn)生球體。至于組織工程，大多數(shù)時候需要特定類型的細(xì)胞群，如干細(xì)胞、自體細(xì)胞、同種異體細(xì)胞、異種細(xì)胞、祖細(xì)胞和多能細(xì)胞。同樣，3D培養(yǎng)使用這些細(xì)胞來獲得球體。此外，這種培養(yǎng)方法還包括這些細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)基因變體，還包括細(xì)胞系或動物來源的原代細(xì)胞

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與纖維蛋白的黏附

由于擔(dān)心免疫排斥，科學(xué)家們更喜歡使用自體或充其量是同種異體的細(xì)胞，盡管它們并不是沒有缺陷。事實(shí)上，在處理所有上述類型的細(xì)胞時，人們應(yīng)該記住，低可獲得性(3D培養(yǎng)中大多數(shù)細(xì)胞類型的常見問題)、在體外增殖能力方面遇到的困難或缺乏臨床應(yīng)用可能是主要的不利因素。然而，與其他類型的細(xì)胞不同，祖細(xì)胞和多潛能細(xì)胞顯示出有希望的結(jié)果，因?yàn)闆]有受到前面提到的所有限制的負(fù)擔(dān)。事實(shí)上，它們區(qū)分不同血統(tǒng)的能力是許多科學(xué)家深入研究的一個令人震驚的屬性。研究人員正竭力在體外控制這一過程，因?yàn)楦杉?xì)胞在體內(nèi)和體外的生長存在巨大差異。干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)為體內(nèi)分化的多能干細(xì)胞(IPS)。它們也可以從胰腺、心血管系統(tǒng)、腦、肺、肝、脂肪組織和骨髓等大量組織中分離出來。

【在3D細(xì)胞培養(yǎng)中生長的細(xì)胞可以是干細(xì)胞、自體細(xì)胞、同種異體細(xì)胞、異種細(xì)胞、祖細(xì)胞和多潛能細(xì)胞。它們形成稱為球體的多層聚集體，顯示出類似組織的組織，由于它們在結(jié)構(gòu)上接近體內(nèi)器官組織，因此在許多應(yīng)用中被使用。最后，通過細(xì)胞連接和可溶性因子，可以觀察到細(xì)胞或基質(zhì)之間的直接和間接相互作用。】

4.3D細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用

【作為一種研究細(xì)胞在反映活體條件的環(huán)境中行為的工具，3D細(xì)胞培養(yǎng)提供了許多應(yīng)用。以下是一些最著名和最有用的可用方法。】

4.1.組織工程中的三維細(xì)胞培養(yǎng)

對于普通或個別患者，3D細(xì)胞培養(yǎng)最近已成為組織工程領(lǐng)域的重大突破。事實(shí)上，3D細(xì)胞培養(yǎng)提供了解決組織修復(fù)的替代方法，組織再生和重建可能大大受益于3D細(xì)胞培養(yǎng)。

事實(shí)上，代替使用生物材料，可以在3D培養(yǎng)中使用微結(jié)構(gòu)纖維支架(例如用于皮膚重建的上皮真皮)來生成人體組織。不幸的是，組織工程可能非常昂貴，而且一些國家對這一應(yīng)用的監(jiān)管沒有很好的定義。
盡管如此，3D培養(yǎng)仍然是進(jìn)行干細(xì)胞和細(xì)胞分化研究的可靠方法。了解錯綜復(fù)雜的機(jī)制，如成骨細(xì)胞如何轉(zhuǎn)變?yōu)楣羌?xì)胞，現(xiàn)在是可能的，而且是可重復(fù)的。在這種情況下，成骨可以通過干細(xì)胞表達(dá)I型膠原標(biāo)記物(CBFA-1、堿性磷酸酶、骨聯(lián)素、骨橋蛋白和JNK2)來觸發(fā)。因此，生產(chǎn)出的具有所需特性的細(xì)胞可以被注射到骨骼病變內(nèi)，以重建受損組織。

4.2.微流控三維細(xì)胞培養(yǎng)：器官芯片

隨著能夠精確控制微環(huán)境參數(shù)的微流控技術(shù)的發(fā)展，利用生物兼容的微流控芯片建立了長期可控的3D細(xì)胞培養(yǎng)模型，方便了組織的操作和研究。這些芯片上的器官是仿生系統(tǒng)，通過模仿器官的微觀結(jié)構(gòu)、動態(tài)機(jī)械特性和生化功能來復(fù)制活器官的關(guān)鍵功能。
器官芯片通過改進(jìn)現(xiàn)有的方法和帶來新的可能性，改變了3D細(xì)胞培養(yǎng)的方式：

為了更好地復(fù)制活組織的組織和功能，由膠原蛋白或聚合物基膜制成的微結(jié)構(gòu)被構(gòu)建在芯片微通道內(nèi)。與傳統(tǒng)的3D細(xì)胞培養(yǎng)不同，這些結(jié)構(gòu)實(shí)際上可以重建在體內(nèi)觀察到的功能。例如，人類呼吸的肺器官芯片就是肺泡毛細(xì)血管的模型。它集成了一層柔性聚合物膜，可以像在活人肺內(nèi)一樣運(yùn)動。

呼吸中的肺器官芯片

微流控技術(shù)使芯片上的器官能夠在不同的尺度上進(jìn)行精確的流動控制，以“灌溉”細(xì)胞培養(yǎng)。因此，通過為細(xì)胞帶來必要的營養(yǎng)和其他元素來創(chuàng)造時空梯度是可能的。
器官芯片還可以促進(jìn)創(chuàng)建分隔的微流控系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)受控共培養(yǎng)并重建組織-組織界面。因此，可以發(fā)展許多疾病模型：例如，在惡性乳腺腫瘤和腦腫瘤的情況下，不同組織類型之間的溝通，或者當(dāng)乳腺癌細(xì)胞成為浸潤性癌時的行為。
這項(xiàng)新技術(shù)完美地滿足了挑剔和復(fù)雜的3D細(xì)胞培養(yǎng)要求。事實(shí)上，它有助于模擬組織界面以模擬器官功能，同時徹底監(jiān)控和調(diào)節(jié)微環(huán)境(化學(xué)信號、流體流動、機(jī)械現(xiàn)象)。作為三維細(xì)胞培養(yǎng)的宿主，微通道連接到流經(jīng)其中的流體混合的孔。這些通道由微流控輸出設(shè)備(流量測量和控制系統(tǒng))精確控制，這些設(shè)備調(diào)節(jié)微環(huán)境中的流量。
通過使用微流控芯片，微通道內(nèi)的受控細(xì)胞生長由提供足夠的機(jī)械、化學(xué)和表面特性的適當(dāng)載體引導(dǎo)。歸根結(jié)底，通過芯片上的器官獲得的結(jié)果是組織良好的組織，更能代表體內(nèi)器官結(jié)構(gòu)及其過程。由于這種節(jié)省時間的仿生模型，藥物開發(fā)研究很容易進(jìn)行，以便在器官尺度或系統(tǒng)尺度(芯片上的多個器官)上研究人類的生理反應(yīng)。

4.3.3D細(xì)胞培養(yǎng)在藥物檢測中的應(yīng)用

藥物發(fā)現(xiàn)研究通常使用動物模型進(jìn)行，已有30多年的歷史[46]。起初，這種做法在制藥行業(yè)是一項(xiàng)可管理的例行任務(wù)。然而，隨著時間的推移，可用的藥物分子越多，高通量藥物篩選就變得越昂貴，進(jìn)行這些測試所需的時間也就越長。伴隨著這一現(xiàn)象，引發(fā)了關(guān)于動物藥物測試的倫理爭議，這些測試甚至沒有很好地轉(zhuǎn)化為人類應(yīng)用。從那時起，3D培養(yǎng)通過提供與2D或動物細(xì)胞培養(yǎng)非常相似的體內(nèi)反應(yīng)在一定程度上解決了這些問題。事實(shí)上，一些研究表明，在3D培養(yǎng)中生長的細(xì)胞對藥物治療的抵抗力更強(qiáng)，而使用其他培養(yǎng)方法則顯示出有希望的結(jié)果。

因此，3D細(xì)胞培養(yǎng)也可以被描述為一種用于藥物篩選的成本效益/節(jié)省時間的培養(yǎng)技術(shù)，因?yàn)樗鼧O大地縮短了藥物試驗(yàn)周期，同時使藥物試驗(yàn)更精確或更有針對性。例如，使用微工程應(yīng)用(芯片上的器官)，癌癥治療正在變得更好，通過更精確地針對特定細(xì)胞類型、明確的生物機(jī)制、精確的受體等來改善收益-風(fēng)險(xiǎn)平衡。不幸的是，仍然有太多藥物測試由于無法提供無進(jìn)展生存而不斷失敗。事實(shí)上，盡管3D細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的組織與實(shí)際的自然組織之間可能更接近活體，但仍存在差距。

【3D細(xì)胞培養(yǎng)呈現(xiàn)了許多有趣的應(yīng)用。其中，組織工程學(xué)專門通過注入3D細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的新組織來修復(fù)受損組織。這種培養(yǎng)方法試圖盡可能地縮小體外和體內(nèi)藥物測試模型之間的差距。因此，有越來越多的靶向癌癥治療方法可用。芯片器官和微流控等微工程應(yīng)用極大地促進(jìn)了藥物檢測過程的改進(jìn)。它們提供了對3D細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的精確控制，并允許比以前更精確和更容易地研究器官生理學(xué)。】

關(guān)于3D細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)論

細(xì)胞在三維環(huán)境中自然生長、成熟和分化。使用3D培養(yǎng)是在體外重現(xiàn)這一過程的準(zhǔn)確方法。這就是為什么科學(xué)家們一直在研究廣泛的細(xì)胞類型，包括干細(xì)胞、自體細(xì)胞、同種細(xì)胞、異種細(xì)胞、祖細(xì)胞和多能細(xì)胞。與2D單層細(xì)胞培養(yǎng)不同，3D細(xì)胞培養(yǎng)模型幾乎可以完美地模擬體內(nèi)細(xì)胞的行為和組織(形態(tài)和生理)?？梢酝ㄟ^使用腳手架或無腳手架的方法來組裝多層3D單元結(jié)構(gòu)。無論是否使用支架，由于細(xì)胞連接和可溶性因子的作用，構(gòu)成球體的細(xì)胞可以通過直接和間接的相互作用在自身和基質(zhì)/載體之間相互作用。如今，組織工程等許多應(yīng)用都源于3D細(xì)胞培養(yǎng)，這也得益于微流控芯片器官的出現(xiàn)，這也有助于改進(jìn)藥物測試。然而，隨著3D細(xì)胞培養(yǎng)的科學(xué)家們?nèi)栽谂φ莆掌渲械脑E竅。