汶顥微流控毛細(xì)管電泳芯片

1.微流控芯片毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)

芯片毛細(xì)管電泳技術(shù)將常規(guī)的毛細(xì)管電泳操作在芯片上進(jìn)行，利用玻璃、石英或各種聚合物材料加工微米級(jí)通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，對(duì)樣品進(jìn) 行進(jìn)樣、分離及檢測(cè)。它與常規(guī)毛細(xì)管電泳的分離 原理相同，因此在分離生物大分子樣品方面具有優(yōu) 勢(shì)。此外，與常規(guī)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)相比，芯片毛細(xì)管電泳系統(tǒng)還具備分離時(shí)間短、分離效率高、系統(tǒng)體積 小且易實(shí)現(xiàn)不同操作單元的集成等優(yōu)點(diǎn) 。芯片毛細(xì)管電泳的上述優(yōu)點(diǎn)使其成為蛋白質(zhì)分離分析中的重要手段之一。

Rodriguez等曾分別在常規(guī)毛細(xì)管、短毛細(xì)管和玻璃芯片上，以區(qū)帶電泳的分離模式，對(duì)人免疫球蛋白 G（ IgG>）和熒光素異硫氰酸酯（FITC）的反應(yīng)混合物進(jìn)行分離，以比較3種系統(tǒng)的分離性能。 使用有效分離長度為35cm的長毛細(xì)管和有效分離長度為6cm的短毛細(xì)管時(shí)，其分離時(shí)間分別為335s和84s，理論塔板數(shù)分別為27750和 41816。 當(dāng)使用有效分離長度僅為2.8cm的玻璃芯片時(shí)， 分離時(shí)間縮短至16s，理論塔板數(shù)達(dá)到49000。由此可以看出采用玻璃芯片進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳在分 離速度和柱效上明顯優(yōu)于常規(guī)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)。

2.微流控芯片毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)的模式

目前，報(bào)道的芯片毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì) 主要采用區(qū)帶電泳、凝膠電泳、等電聚焦、膠束電動(dòng)色譜及二維電泳等模式。

2.1芯片毛細(xì)管區(qū)帶電泳

毛細(xì)管區(qū)帶電泳是芯片毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)的一種最基本的分離模式。它基于不同的蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中的遷移速率不同而實(shí)現(xiàn)分離，是一種簡 單、快速的分離方法。采用區(qū)帶電泳分離模式已成 功地分離了多種蛋白質(zhì)樣品。

在芯片毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)的研究中所要解決的一個(gè)重要問題就是通道表面對(duì)大分子蛋白質(zhì)的吸附問題。蛋白質(zhì)與芯片通道內(nèi)壁之間的微小吸附效應(yīng)就會(huì)降低蛋白質(zhì)的分離效率，引起峰形變寬拖尾，影響分離的重現(xiàn)性。在毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離模 式下，一般采用通道內(nèi)壁永久改性和緩沖液中加入添加劑進(jìn)行 動(dòng) 態(tài)修飾兩種方法來抑制蛋白質(zhì)的吸附。

Wu等采用多層88%水解聚丙烯醇（PVA） 修飾PDMS芯片，以區(qū)帶電泳模式有效分離了兩種堿性蛋白質(zhì)（溶菌酶和核糖核酸酶）以及兩種典型的酸性蛋白質(zhì)（ 牛血清白蛋白和β-乳球蛋白）。該涂層在ph3-11范圍內(nèi)均可抑制電滲流的產(chǎn)生和蛋白的吸附作用，并且效果穩(wěn)定，連續(xù)運(yùn)行70次后分離效果仍然很好。該研究組隨后又采用自組裝方法在PDMS芯片通道表面加工環(huán)氧修飾的聚合物涂層抑制蛋白質(zhì)的吸附，成功地分離溶菌酶和核糖核酸酶A。

Chiem等在運(yùn)行緩沖液中加入了無機(jī)電解質(zhì) ,NaCI和中性表面活性劑吐溫20 來抑制蛋白質(zhì)的吸附，利用芯片毛細(xì)管區(qū)帶電泳進(jìn)行了單克隆抗體的分離分析。

2.2芯片毛細(xì)管凝膠電泳

在蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)分離研究中，凝膠電泳是廣泛使用的分離技術(shù)。它是以凝膠等聚合物作為分離介質(zhì)，利用其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并依據(jù)被測(cè)組分的分子體積不同而進(jìn)行分離的一種分離模式。在芯片上采用凝膠電泳模式分離蛋白質(zhì)，更有利于實(shí)現(xiàn)分離操作的高速度和高效率。Yao等［采用十二烷基磺酸鈉（SDS）凝膠電泳分離模式，對(duì)比了芯片SDS毛 細(xì)管凝膠電泳與常規(guī)毛細(xì)管凝膠電泳系統(tǒng)分離蛋白質(zhì)的性能，結(jié)果表明前者的分離效率明顯優(yōu)于后者， 分離時(shí)間也明顯低于后者。

與常規(guī)毛細(xì)管凝膠電泳相同，芯片毛細(xì)管凝膠電泳常用的篩分介質(zhì)也分為凝膠和非膠聚合物溶液兩種。交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠是廣泛使用的一種凝膠篩分介質(zhì)，Herr等首次將傳統(tǒng)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)的方法移植到芯片上，采用光聚合的方法在芯片通道內(nèi)制備濃度為6%的交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠作為篩分介質(zhì)，在30s的時(shí)間內(nèi)對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在6500~39000之間的 5種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，分離距離僅為4mm，分離效率達(dá)到理論塔板數(shù) 4.41x十的五次方。該研究組后期又在微通道內(nèi)制備了濃度為 22%的交聯(lián)聚丙烯酰胺膜用于蛋白質(zhì)樣品的預(yù)富集，有效富集了相對(duì)分子質(zhì)量為（12000~205000）的蛋白質(zhì)分子，并采用濃度為8%的交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠作為篩分介質(zhì)進(jìn)行分離。

在芯片毛細(xì)管凝膠電泳中，通道內(nèi)壁對(duì)蛋白質(zhì)的吸附仍是需要解決的重要問題。Bousse等使 聚二甲基丙烯酰胺（PDMA）物理涂覆玻璃芯片微通道內(nèi)壁，將電滲流降低， 以SDS凝膠電泳的分離模式在40s內(nèi)分離了bio-rad公司的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品，分離效率達(dá)到十的七次方塔板/M。Nagata在PMMA芯片中使用了PEG 涂層，以 5%線性聚丙烯酰胺為篩分介質(zhì)，在分離長度為 3mm的通道內(nèi)實(shí)現(xiàn)了胰蛋白酶抑制劑、牛血清白蛋白和β-半乳糖苷酶3種蛋白質(zhì)的高速分離， 分離時(shí)間僅為8s。

2.3芯片等電聚焦分離

芯片等電聚焦分離蛋白質(zhì)的原理與常規(guī)毛細(xì)管 等電聚焦基本相同，都是依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（ pI） 不同而進(jìn)行分離。Hofmann等首次將毛細(xì)管等電聚焦技術(shù)移植于玻璃芯片，應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析。 Li等在PDMS芯片和聚碳酸酯（PC）芯片上，采用等電聚焦模式分離了牛血清白蛋白和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）。Das等采用高聚物芯片，在等電聚焦電泳模式下優(yōu)化了分離長度及電壓條件， 最終在長1.9cm的通道內(nèi)于1.5min內(nèi)分離了綠熒光蛋白和R藻紅蛋白，分離電壓為500V。Cui等在 PDMS芯片上采用等電聚焦分離模式成功分離了重組綠熒光蛋白、異藻青蛋白和藻紅蛋白。 該作者還報(bào)道，通過改變樣品和分離介質(zhì)中添加劑 甲基纖維素的濃度，可以改變完成蛋白質(zhì)分離所需要的通道距離。

2.4芯片膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳

膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳是毛細(xì)管電泳與膠束增溶色譜相結(jié)合的分離技術(shù)，其原理是在裝有膠束溶液的通道內(nèi)，溶質(zhì)組分在電場(chǎng)力的作用下根據(jù)其在膠 束相和水相之間的分配不同而產(chǎn)生分離。Jin等在玻璃芯片上采用膠束電動(dòng)色譜的分 離模式，以 Bio-Rad 公司的CE-SDS緩沖液作為分離介質(zhì)，成功實(shí)現(xiàn)了相對(duì)分子質(zhì)量在 14400~200000之間的8種蛋白質(zhì)的分離。Doud等采用 Brij35修飾PDMS 芯片通道，在膠束電動(dòng)色譜的分離模式下實(shí)現(xiàn)了葡萄糖氧化酶和肌紅蛋白的有效分離。該芯片涂層在ph2~6范圍內(nèi)可顯著降低蛋白質(zhì)大分子的吸附， 并減少檢測(cè)蛋白質(zhì)所需的沖洗時(shí)間，從而提高分離效率。Huang等在 PDMS芯片中采用0.1% 十二烷基麥芽糖（DDM）和 0.03%SDS作為混合膠束，對(duì)通道進(jìn)行動(dòng)態(tài)修飾，有效地抑制了蛋白質(zhì)的吸附，控制了電滲流，使蛋白質(zhì)在非變性條件下得到有效分離。

2.5芯片二維電泳分離

芯片毛細(xì)管電泳應(yīng)用的成功促進(jìn)了高速高效的 芯片二維電泳技術(shù)的發(fā)展。對(duì)于多組分的復(fù)雜蛋白 質(zhì)樣品，采用傳統(tǒng)的一維分離方法通常無法滿足要 求，需要采用二維分離技術(shù)來提高分離效率，增加峰 容量。與傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳系統(tǒng)相比，在芯片上進(jìn)行二維電泳分離，可以通過設(shè)計(jì)芯片通道結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn) 通道的直接交叉或連通，而無需制作復(fù)雜的二維毛細(xì)管電泳接口，從而避免了因在接口處存在死體積 而導(dǎo)致的譜帶擴(kuò)展現(xiàn)象。

在芯片二維電泳分離蛋白質(zhì)的研究中，第一維分離模式多采用等電聚焦模式。Chen等制作了二維毛細(xì)管電泳PDMS芯片，利用第一維的等電聚焦和第二維的凝膠電泳對(duì)熒光標(biāo)記的牛血清白蛋白和碳酸酐酶以及德科薩斯紅標(biāo)記的卵清蛋白進(jìn)行分離分析。Li等設(shè)計(jì)了等電聚焦和凝膠電泳聯(lián)用 的二維分離高聚物芯片。蛋白質(zhì)樣品在完成第一維的等電聚焦分離后，可在多個(gè)并行的通道內(nèi)完成第 二維的凝膠電泳分離。整個(gè)分離過程在 10min內(nèi)完成，峰容量達(dá)到1700。Herr等研制了采用十字通道構(gòu)型的等電聚焦,自由區(qū)帶電泳二維芯片系統(tǒng)，芯片通道寬200微米深20微米，待測(cè)樣品在橫向通道中進(jìn)行等電聚焦分離，分離后的樣品區(qū)帶在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入縱向區(qū)帶電泳通道中進(jìn)行第二維分離。系統(tǒng)采用熒光顯微鏡成像的方法對(duì)分離性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，5min內(nèi)分離的峰容量達(dá)到1300。Wang 等通過在PDMS芯片中制作微閥來防止一維等電聚焦和二維凝膠電泳系統(tǒng)之間的分離緩沖液相混合，在20min內(nèi)有效分離了4種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。也有報(bào)道在PMMA 芯片上進(jìn)行SDS凝膠電泳和膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳相結(jié)合的蛋白質(zhì)二維電泳分離。 該系統(tǒng)在12min內(nèi)完成10種蛋白質(zhì)的分離，峰容量約為1000。

2.6芯片自由流電泳

除上述分離模式外，芯片自由流電泳也是芯片電泳分離蛋白質(zhì)的重要方法。芯片自由流電泳是指在芯片中通過外加電場(chǎng)使樣品隨緩沖液連續(xù)流動(dòng)的 同時(shí)沿電場(chǎng)方向進(jìn)行電遷移，從而按照電泳淌度不同實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離模式。,Raymond 等采用芯片自由流電泳模式分離了人血清蛋白、緩激肽和核糖核酸酶A，其分離長度為3.1cm，流出時(shí)間為62s。Kobayashi等采用自由流電泳的分離模式 在一個(gè)體積為56.5mmx35mmx30微米的微分離室（60微升）中實(shí)現(xiàn)了持續(xù)的蛋白質(zhì)分離，并用羥丙基甲基纖維素涂覆來抑制蛋白質(zhì)吸附，在25min 內(nèi)有效分離了細(xì)胞色素C 和肌紅蛋白。最近，Kohl-heyer等制作了一種自由流等電聚焦分離蛋白質(zhì)的玻璃芯片，成功地將人血清白蛋白（pI=4.4）與等電聚焦標(biāo)記物（pH3和9）分離。

微流控芯片毛細(xì)管電泳系統(tǒng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離分析具有突出的優(yōu)越性，特別是在臨床檢驗(yàn)及現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)等方面的應(yīng)用具有良好的發(fā)展前景，同時(shí)，其對(duì)分析儀器的集成化、微型化與便攜化的發(fā)展也具有重要意義。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Renzi等已經(jīng)研制出手持式的微流控芯片電泳分離蛋白質(zhì)裝置。該裝置由電泳芯片、小型激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)以及高壓電源等組成，其體積僅為11.5cmx11.5cmx19.0cm，可用于現(xiàn)場(chǎng)分析、床旁醫(yī)學(xué)診斷以及取證 分析。近年來，國內(nèi)已有關(guān)于利用芯片毛細(xì)管電泳進(jìn)行臨床尿蛋白和脂蛋白檢測(cè)的報(bào)道。最 近，Pandey等使用 Caliper公司和Agilent公司的P200蛋白質(zhì)芯片來檢測(cè)微量的白蛋白尿，將蛋白質(zhì)的電泳分離和熒光檢測(cè)集成化、自動(dòng)化，實(shí)現(xiàn)了其在臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。

目前，很多科研工作者正致力于微流控芯片毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的研究，以進(jìn)一步提高系統(tǒng)對(duì)復(fù)雜樣品的分離分析能力。上述系統(tǒng)在蛋白質(zhì)分離分析及蛋白質(zhì)組研究中有廣闊的應(yīng)用前景。尤其是對(duì)于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的多維分離分析，芯片毛細(xì)管電泳以其快速高效的特點(diǎn)，可以作為其中的一維分離方法，顯著提高蛋白質(zhì)的分析通量。相信隨 著研究的不斷深入及相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，微流控芯片毛細(xì)管電泳蛋白質(zhì)分離技術(shù)將日趨成熟，在生化分析、臨床診斷和蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。（文章節(jié)選來源：浙江大學(xué)微分析系統(tǒng)研究所 文章編號(hào)：1000-8713（2008）03-0269-05 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）