隨著老齡化社會的到來，與骨相關(guān)的疾病，例如骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為人類的主要健康問題，并且由癌癥骨轉(zhuǎn)移引起的溶骨性病變的預(yù)后一直很差。研究人員已經(jīng)研究了這些骨科疾病的發(fā)病機理，從而獲得了有效的治療方法。微流體芯片技術(shù)是近年來開發(fā)的流行技術(shù)。這項技術(shù)可以建立一個仿生的實驗平臺，在體內(nèi)微環(huán)境體外，這已經(jīng)受到越來越多的研究人員的青睞。在這篇綜述中，我們將以骨質(zhì)疏松癥和癌癥骨轉(zhuǎn)移為例來說明發(fā)病機理，介紹微流體模型與骨科相關(guān)疾病研究的最新進展，并描述當(dāng)前的方法及其局限性。

介紹

骨科作為現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)的重要分支，主要研究骨骼肌系統(tǒng)的生理學(xué)和病理學(xué)，并借助藥物、外科手術(shù)或其他物理手段維持該系統(tǒng)的正常功能和形態(tài)。隨著社會的進步和時代的變遷，骨科的傷害譜也發(fā)生了巨大變化。例如普遍地減少了諸如脊髓灰質(zhì)炎、骨髓炎、骨骼和結(jié)核病之類的疾病，但是交通事故造成的創(chuàng)傷大大增加了。人口老齡化還導(dǎo)致了老年性骨質(zhì)疏松癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨腫瘤的相應(yīng)增加。這種變化表明，骨科研究的重點也必須適應(yīng)骨科的未來發(fā)展。骨科的未來發(fā)展不僅應(yīng)加強與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的融合，而且應(yīng)將其他學(xué)科的研究成果轉(zhuǎn)化為可用的技術(shù)。例如，人工關(guān)節(jié)的進一步改進離不開材料科學(xué)和技術(shù)的發(fā)展。及時有效地將其他學(xué)科的新技術(shù)成果應(yīng)用于臨床骨科，可以大大改善骨科疾病的診斷和治療。

近年來，微流控芯片技術(shù)逐漸普及，在生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。細胞是生命活動的基本單位。近年來，細胞研究已從細胞水平發(fā)展到分子水平，形態(tài)學(xué)研究確定了亞微觀結(jié)構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)，以進一步了解生命活動和發(fā)展的規(guī)律。微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn)被認為是細胞研究的新的重要技術(shù)平臺。微流控芯片也稱為“芯片實驗室”，是一種將生物，化學(xué)和其他實驗集成在幾平方厘米的芯片上的新型科學(xué)技術(shù)，該芯片可以集成樣品制備、反應(yīng)、分離并檢測為一體。

細胞研究中使用的微流控芯片技術(shù)具有以下優(yōu)點：1）芯片尺寸小，通?？梢钥刂圃?0–100μm的范圍內(nèi)，而哺乳動物細胞的直徑大約為10–20μm，適用于它的成長；2）芯片的通道環(huán)境相對封閉，可以構(gòu)建多維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以形成接近生理狀態(tài)的細胞空間特征；3）微觀通道環(huán)境增加了傳熱，傳質(zhì)和氣體交換的速率；4）可用于高通量細胞分析，可同時采集多種生物信號；5）芯片上的多個單元可以靈活組合，并且可以進行集成的細胞研究。因此，細胞注射，培養(yǎng)，篩選，裂解，分離和檢測可以集成在同一芯片上。除了可控制的芯片結(jié)構(gòu)外，還有許多芯片材料可供選擇。聚二甲基硅氧烷（PDMS）是一種高分子量有機硅化合物，是制備微流控芯片中使用最廣泛的材料之一。

將生物醫(yī)學(xué)臨床研究與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合可以將這項技術(shù)帶入一個新的領(lǐng)域，也可以在生物醫(yī)學(xué)研究中取得一些突破。本文以整形外科中最常見的情況，骨質(zhì)疏松和癌細胞轉(zhuǎn)移為例，并列舉了微流控芯片技術(shù)發(fā)揮的重要作用。

骨質(zhì)疏松微流模型的建立與應(yīng)用

骨質(zhì)疏松癥是目前臨床上最常見的骨科代謝疾病之一。這是由于每單位體積的骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞的多種原因引起的。臨床特征主要是骨痛，骨脆性增加和容易骨折。骨質(zhì)疏松癥可分為三類：原發(fā)性，繼發(fā)性和特發(fā)性。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥約占90％，分為I型（絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，PMOP）和II型（老年性骨質(zhì)疏松癥，SOP）。繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是由諸如糖尿病，甲狀腺功能低下，白血病和惡性腫瘤等疾病或使用諸如糖皮質(zhì)激素，肝素和免疫抑制劑等藥物引起的。特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥在8-14歲的青少年中更為常見。

在過去的20年中，人們還通過各種方式研究了骨質(zhì)疏松癥的病理過程。他們表明，在骨重建過程中骨形成缺陷是骨質(zhì)疏松癥的主要病理機制。在壓力原理下，骨骼不斷更新，破骨細胞去除舊骨（骨吸收），然后成骨細胞添加新骨（骨形成）。當(dāng)成骨細胞介導(dǎo)的骨形成不如破骨細胞吸收骨有效時，就會發(fā)生骨質(zhì)流失，骨礦物質(zhì)密度（BMD）降低，嚴重時會發(fā)生骨質(zhì)疏松癥（Bartelt等，2018）。在細胞水平上，成骨細胞和破骨細胞的相互作用和偶聯(lián)構(gòu)成了骨骼的最小功能單元，一些重要的分子在骨骼重建過程中協(xié)調(diào)了這兩個細胞之間的活動（Kim和Koh，2019年））。破骨細胞是源自造血干細胞的單核細胞-巨噬細胞前體分支。完全活化的多核破骨細胞與破骨細胞前體細胞不同。分化過程受巨噬細胞集落刺激因子和核因子-κB配體的受體激活劑（RANKL）的調(diào)節(jié)。許多不同的激素和炎性因子通過RANKL途徑調(diào)節(jié)破骨細胞的生理功能。成骨細胞不同于骨髓間充質(zhì)干細胞。前體細胞分化為成熟成骨細胞的速率和效率以及成骨細胞的壽命決定了骨形成的速率（Chen等，2018）。在分子水平上，經(jīng)典Wnt /βcatenin途徑的激活是成骨細胞分化的重要開關(guān)。骨硬化蛋白和Dickkopf1相關(guān)蛋白1（Dkk1）通過結(jié)合并破壞Wnt受體LRP-5來抑制該合成代謝途徑。成骨細胞釋放硬化分子和Dkk1等信號分子，使成骨細胞保持靜止。周期性的機械負荷可以通過骨細胞下調(diào)這些抑制因子的表達水平，從而激活成骨細胞的發(fā)育以形成新的骨。一項小鼠尺骨負荷研究表明，在尺骨的較高應(yīng)變區(qū)域中，骨硬化蛋白的產(chǎn)生顯著減少，并且在這些位點7天后，這些部位的局部成骨作用也得到了增強Robling等2008這些監(jiān)管機制非常重要，并且是新藥開發(fā)的主要目標(biāo)。例如，針對硬化蛋白和Dkk1的抗體可在臨床上用于治療溶骨性病變和骨質(zhì)疏松癥。

因此，成骨分化和骨重塑是治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵，但由于各種原因，成骨細胞的體內(nèi)研究仍面臨重大挑戰(zhàn)。維持原代骨細胞的原始生理功能很困難。即使在借助生物支架進行3D培養(yǎng)，生物反應(yīng)器中的動態(tài)灌注以及施加機械載荷的情況下，成骨細胞在體外培養(yǎng)過程中也難以形成穩(wěn)定的3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。例如，Boukhechba等2009年使用雙相磷酸鈣（BCP）顆粒培養(yǎng)人類原代成骨細胞。與二維培養(yǎng)相比，向成骨細胞樣表型的分化顯著，成骨細胞特異性標(biāo)志物被下調(diào)，而成骨細胞標(biāo)志物被上調(diào)。但是，在40-80μm的BCP顆粒間隙中會生成隨機細胞聚集體，并且不會生成有序的3D細胞網(wǎng)絡(luò)。為了模擬體外的骨骼重塑環(huán)境，Mulcahy等人2011年使用Matrigel中的仿生細胞自我仿生過程成功地將骨細胞樣小鼠細胞系（MLO-Y4）培養(yǎng)成3D網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，但該結(jié)構(gòu)中的細胞間距約為100μm，無法控制為模擬小鼠骨骼的大小為20–30μm。細胞大小對于骨骼細胞生長和機械傳導(dǎo)過程中的信號傳遞非常重要。同樣，隨著凝膠培養(yǎng)時間的增加，骨細胞在28天后自由增殖并最終破壞了原始的有序細胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

微流體3D組織模型可以更好地模擬生理和臨床相關(guān)的微環(huán)境。Lee等2012年集成了帶有微圖案和微流體裝置的載玻片，該載玻片上有八個由聚二甲基硅氧烷制成的培養(yǎng)室，并在微流體培養(yǎng)室中成功地培養(yǎng)了3D“初級骨組織”。需要進一步的研究以確定成骨細胞是否可能已經(jīng)分化為骨細胞，并且組織結(jié)構(gòu)的強度不足以應(yīng)付機械負荷。如圖1A所示，Gu等2015年探索了一種新的仿生方法來復(fù)制3D骨骼網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。他們在PDMS微流腔室中組裝了大小為20–25 μm的雙相磷酸鈣微珠和鼠早期骨細胞（MLO-A5），以模擬3D淚管結(jié)構(gòu)的生理微環(huán)境?？梢酝ㄟ^長期微流灌注來培養(yǎng)骨細胞，最后獲得了致密且機械穩(wěn)定的3D網(wǎng)絡(luò)組織結(jié)構(gòu)。該方法可用于觀察成骨細胞的礦物質(zhì)沉積，并已廣泛用于體外研究骨細胞的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)。喬治等2018建立了一個生理芯片實驗室（LOC），以整合三種主要類型的骨細胞（成骨細胞，成骨細胞和破骨細胞）并消除時空限制。該平臺有助于機械負載和骨骼重塑。為了更好地觀察細胞，Sheyn等2019準(zhǔn)備了PDMS微流體骨芯片，將其與光學(xué)成像方法相結(jié)合以實時監(jiān)測細胞存活，增殖和成骨分化。證明在恒定和連續(xù)的介質(zhì)流動條件下，細胞的成骨分化更高。該芯片設(shè)計可以提供一個平臺，用于體外測試細胞對環(huán)境的反應(yīng)以及細胞的光學(xué)成像。

圖1.微流體骨組織模型的例子。（A）通過微珠引導(dǎo)的重建在微流室內(nèi)培養(yǎng)3D骨網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。（B）一種微流控芯片，可同時測量細胞侵襲和外滲。（C） 3D礦化的膠原蛋白骨組織芯片，用于乳腺癌細胞和成骨細胞的共培養(yǎng)。

此外，已經(jīng)開發(fā)了許多基于成骨細胞的用于藥物篩選的3D微型系統(tǒng)。例如，Nason等2011年設(shè)計了一種微流控設(shè)備，用于細胞藥理學(xué)的體外測試，以此作為區(qū)分濃度范圍的工具，該濃度范圍保證了該藥物對雷奈酸鍶的抗骨質(zhì)疏松癥治療的有效性。

通過微流控技術(shù)探討骨轉(zhuǎn)移的機制

許多癌癥，包括前列腺癌，乳腺癌，多發(fā)性骨髓瘤和肺癌，在晚期階段都有很高的骨轉(zhuǎn)移可能性，導(dǎo)致存活率顯著下降（Hao等，2018）。這些轉(zhuǎn)移可引起一系列與骨骼有關(guān)的疾病，例如脊髓壓迫，病理性骨折，高鈣血癥和骨痛。盡管采取了多種治療策略，但轉(zhuǎn)移性骨病的預(yù)后很差（Wu等，2017）。因此，有必要構(gòu)建仿生骨微環(huán)境的骨轉(zhuǎn)移模型，以更好地了解惡性骨轉(zhuǎn)移，并開發(fā)出新的有效的骨轉(zhuǎn)移治療方法。在過去的幾十年中，涉及三維細胞培養(yǎng)的研究已大大縮小了體外細胞培養(yǎng)模型與體內(nèi)動物模型之間的差距（Chaicharoenaudomrung等，2019）。1989年，斯蒂芬·佩吉特（Stephen Paget）提出了“種子和土壤”假說，將癌細胞的轉(zhuǎn)移與植物種子的傳播進行了比較。為了促進轉(zhuǎn)移灶的形成，“土壤”（即元環(huán)境）必須能夠滋養(yǎng)“種子”（即癌細胞擴散）（Paget，1989年））。當(dāng)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移時，癌細胞會滲出并經(jīng)歷持續(xù)的液體微環(huán)境。因此，在對轉(zhuǎn)移性微環(huán)境進行建模時，需要考慮癌細胞所經(jīng)歷的流體壓力。因此，具有高通量和輕量特性的微流體系統(tǒng)引起了許多研究者的關(guān)注。該系統(tǒng)使用很少的試劑即可達到很高的分析精度和靈敏度，并且可以在體外構(gòu)建類似于人體的3D流動環(huán)境。

低流體條件的流體壓力平衡，這有助于內(nèi)皮和功能性微通道管腔融合，并為惡性腫瘤提供營養(yǎng)支持。與在2D生物學(xué)平臺上培養(yǎng)的細胞相比，在微流體生物學(xué)系統(tǒng)中培養(yǎng)的癌細胞形成球形細胞聚集體，這些聚集體的上皮標(biāo)志物（例如CD326）的表達水平下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志物（例如，波形蛋白，N-鈣黏著蛋白和纖連蛋白）增加（Kuo等人，2012）。在癌癥骨轉(zhuǎn)移過程中，骨質(zhì)疏松癌細胞經(jīng)歷內(nèi)皮運動（浸潤和滲出）和定向遷移。穿過內(nèi)皮的滲透速度與基質(zhì)細胞和癌細胞之間的主動相互作用有關(guān)，癌細胞的靶向遷移取決于歸巢位點的化學(xué)吸引力。迄今為止，許多研究人員已經(jīng)使用微流體系統(tǒng)建立誘導(dǎo)因子的濃度梯度，模擬跨內(nèi)皮遷移過程中內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)對癌細胞施加的剪切應(yīng)力刺激，并且更實際地模擬循環(huán)系統(tǒng)中癌細胞的狀態(tài)。在微流控芯片的幫助下建立的流體動力學(xué)模型可以評估形態(tài)，遺傳物質(zhì)，和與腫瘤細胞遷移相關(guān)的蛋白質(zhì)水平。模擬更接近的微環(huán)境在體內(nèi)條件下，Huang等2009年制造了一個平行的微流體通道，該通道由規(guī)則間隔的柱的線性陣列分隔開，這些通道可以在3D ECM環(huán)境中基于自分泌或旁分泌信號分子對細胞之間的實時相互作用進行成像。維克曼等2008年開發(fā)了一種微流體平臺，用于在生物衍生或合成水凝膠中進行三維細胞培養(yǎng)，可以實時監(jiān)測細胞動態(tài)。通過調(diào)節(jié)刺激因子，例如表皮生長因子（EGF），CXCL12和間質(zhì)血流，Polacheck等2011年成功地將癌細胞穿過單層內(nèi)皮細胞遷移到微流控設(shè)備中的膠原凝膠中，這表明癌細胞滲出過程得到了很好的模擬。此外，如圖1B所示，Shin等人2011年設(shè)計了帶有兩個主要培養(yǎng)室的微流控芯片。腔室I是用于細胞遷移和侵襲測定的血管內(nèi)腔，腔室E是用于定量檢測的滲出腔。該平臺可以同時模擬癌癥轉(zhuǎn)移中的浸潤和外滲過程。該結(jié)果表明，在血管腔中，癌細胞可以在強應(yīng)力下從基質(zhì)凝膠分離，然后粘附在血管外腔中的粘附分子上。

微流體裝置可以模擬骨骼環(huán)境，并有助于癌癥的動態(tài)骨轉(zhuǎn)移過程。Hsiao等2009年將包含內(nèi)皮細胞，成骨細胞和前列腺癌細胞的三培養(yǎng)細胞球接種到微流控生物芯片中。該微流控芯片可以實時監(jiān)測球體內(nèi)細胞的生長，并可以抑制前列腺癌細胞的增殖而不會損害其他細胞的生存能力。Jeon等2015在體外開發(fā)了PDMS微流體3D通過軟光刻技術(shù)建立模型，將內(nèi)皮細胞和骨間充質(zhì)干細胞（BMSC）共培養(yǎng)，建立血管化的骨樣微環(huán)境，可用于研究乳腺癌細胞的外滲。巧合的是，Bersini等2014年設(shè)計了一種用于內(nèi)皮細胞和BMSCs的血管化微流控設(shè)備，包括三個培養(yǎng)基通道和四個獨立的凝膠通道，并引入了乳腺癌MDA-MB-231細胞以形成外滲癌細胞的微轉(zhuǎn)移模型。如圖1C所示，Hao等2018設(shè)計了一種微流體骨芯片，該芯片由頂部培養(yǎng)基儲庫和底部細胞生長室組成，該室由透析膜隔開。骨屑可以自發(fā)生長為厚度為85μm的成熟3D礦化膠原蛋白骨組織，其中包含大量礦化的膠原蛋白纖維。膠原纖維在720小時內(nèi)自然形成，無需分化劑。它們還使癌細胞與骨基質(zhì)相互作用的機會最大化，并且可以經(jīng)常觀察到。由于小型化，簡單的操作和超低的單位成本，這種自發(fā)的3D模型將指導(dǎo)體外癌癥骨轉(zhuǎn)移的研究。

結(jié)論與未來展望

微流體技術(shù)可以通過結(jié)合功能化細胞，細胞外基質(zhì)，細胞生長因子和其他生化刺激物來模擬體內(nèi)骨骼細胞的動態(tài)微環(huán)境。該技術(shù)有助于評估細胞間的相互作用，從而闡明與骨相關(guān)的疾病（如骨質(zhì)疏松癥和骨轉(zhuǎn)移癌）的發(fā)病機理，并可以導(dǎo)致開發(fā)新的治療策略。

但是，這項技術(shù)在骨科領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用之前還有很長的路要走。一方面，人體的內(nèi)部環(huán)境復(fù)雜細膩，目前的模型無法模擬整個系統(tǒng)。特別是在骨轉(zhuǎn)移過程中，癌細胞經(jīng)歷了連續(xù)且密切相關(guān)的多步過程，包括許多不可分割的細胞事件（Qiao and Tang，2018年）。）。另一方面，許多微流體疾病模型現(xiàn)在使用永生化細胞系代替患者來源的活細胞。使用個性化細胞代替細胞系可以幫助開發(fā)定制療法，從而更有效地指導(dǎo)患者治療。在過去的十年中，在再生醫(yī)學(xué)中已經(jīng)廣泛研究了誘導(dǎo)多能干細胞（iPSC）。它們被認為是工程骨組織的有效細胞來源，并且在體外研究中具有強大的骨再生潛力（Rana等，2019）。觀察和評估iPSC與微流體技術(shù)的相互作用是未來研究的新思路，它在研究與骨相關(guān)的疾?。ㄈ绻琴|(zhì)疏松癥和骨轉(zhuǎn)移）的發(fā)病機理方面具有巨大的潛力，并有助于開發(fā)新的治療策略?？偟膩碚f，使用微流控芯片技術(shù)產(chǎn)生仿生骨骼微環(huán)境取得了令人鼓舞的進展，研究人員需要繼續(xù)努力，以更好地了解骨骼疾病的機制，治愈與骨有關(guān)的疾病并改善人類的生活質(zhì)量。

來源：Yang X, Tang Q, Lai C, Wu K and Shi X (2021) Applications and Prospects of Microfluidic Chips in Orthopaedic Diseases. Front. Mater. 7:610558. doi: 10.3389/fmats.2020.610558

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