京都大學物質-細胞綜合系統(tǒng)基地（iCeMS）的龜井謙一郎副教授和Rodi Abdalkader特定助教利用微細加工技術，成功開發(fā)了通過細胞培養(yǎng)系統(tǒng)再現人角膜結構的器件。該研究結果有望用于眼藥水開發(fā)，還可作為所需的動物實驗的代替方案。

圖：研究示意圖（插圖：高宮泉水 iCeMS特定助教）

透明的眼角膜如果生病，會因渾濁等導致視覺障礙，有時甚至可能失明等。為治療這類疾病，人類開發(fā)了眼藥水等治療藥物，但利用兔子等實驗動物無法預測其對人的功效和毒性。不僅因為與實驗動物之間存在物種差異，還因為眨眼的頻率也不同。

所以，此次研究著眼于“微流體器件”，這種器件采用可加工非常小的微米級材料的微細加工技術。利用這種器件，可以再現人體中的血管網絡和組織。通過在該器件上培養(yǎng)人源角膜上皮細胞，并增減細胞培養(yǎng)液，成功開發(fā)出了可以再現眨眼動作的“人角膜模型”。

此次取得的成果不僅能為開發(fā)新的角膜治療藥做出貢獻，還有望作為動物代替方案，減少實驗動物的使用。

背景

我們的生活中有很多“藥物”，藥是健康生活不可或缺的物品。開發(fā)一種新藥需要數百億日元以上的巨額費用和10年以上的漫長時間。另外，并不是所有的藥品開發(fā)都能成功，還存在成功率非常低的課題。

其中，眼藥不僅能改善眼睛干燥和充血，還能治療眼部炎癥和眼病等。開發(fā)眼藥時要評估藥效、安全性和毒性等，但由于使用的是兔子等實驗動物，無法準確進行評價。尤其是兔子，每小時只“眨眼”10～12次，而人每小時眨眼1,000次，相差非常大，這是物種差異的原因之一。因此，亟需開發(fā)能再現人“眼”的新試驗方法。

近年來，作為利用培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)的人體器官模型，采用基于微細加工技術的微流體器件的“Oran on a Chip（器官芯片）”受到關注（圖1）。這是在器件內制作模擬組織結構的模型的技術，可以實現利用以往的細胞培養(yǎng)板等無法再現的組織功能。在2016年的世界經濟論壇上，器官芯片與新一代電池和自動駕駛汽車等一同入選為“十大新興技術（Top 10 Emerging Technologies）”，其重要性與日俱增。

圖1：近年來開始受到關注的器官模型“Organ on a Chip（器官芯片）”
（出處：Huh et al., Lab Chip, 2012, 12, 2156）

研究內容與成果

因此，為開發(fā)可以實施角膜藥物滲透試驗和毒性試驗的體外人體模型（圖2），研究團隊開發(fā)了將人角膜上皮細胞引入微流體器件中的新實驗系統(tǒng)“角膜芯片”（圖3、4）。

圖2：此次研究再現的人角膜結構和眨眼時的眼淚運動

圖3：此次研究開發(fā)的“角膜芯片”概念圖

圖4：角膜芯片

研究團隊開發(fā)該芯片有以下三個目的：①實施藥物的角膜上皮滲透性試驗、②驗證眨眼給角膜上皮細胞施加的剪切應力、③通過剪切應力提高角膜上皮的功能。首先，芯片的材料采用生物相容性高、透氣性和透光性也都比較高的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane：PDMS）。另外，通過在微流體器件內設置多孔膜，在上面培養(yǎng)角膜上皮細胞，可以評估角膜上皮細胞的成膜性和藥物滲透性。此外，為再現眨眼的剪切應力，使用了可雙向驅動的注射泵。

圖5：在角膜芯片內培養(yǎng)的角膜上皮細胞的ZO-1蛋白質（綠色）表達。角膜發(fā)揮作用需要ZO-1。與以往的方法（利用通透性嵌套（Transwell））相比，可以確認表達量增加。左圖比例尺為50μm，右圖比例尺為100μm。

研究團隊利用免疫細胞染色法確認了在制作的芯片內培養(yǎng)的人角膜上皮細胞（HCE-T）的膜功能（圖5）?？梢源_認，發(fā)揮膜功能所需的ZO-1蛋白質在培養(yǎng)的第7天強烈表達，另外還確認，其表達比以前使用通透性嵌套的培養(yǎng)更強。

圖6：在角膜芯片內培養(yǎng)的角膜上皮細胞中的CK-19蛋白質（紅色）的表達。角膜成熟需要CK-19?？梢源_認，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，施加雙向剪切應力的話，CK-19的表達會增加。比例尺為50μm。

接下來，利用免疫細胞染色法確認了雙向剪切應力對角膜上皮細胞成熟的影響（圖6）。經確認，隨著施加雙向剪切應力，角膜成熟標志物CK-19蛋白的表達增強。由此確認，此次研究開發(fā)的“角膜芯片”能以功能更高的狀態(tài)培養(yǎng)角膜。

未來展望

此次研究成功開發(fā)了不僅是角膜結構，還再現了眨眼動作的體外人體模型“角膜芯片”。該芯片作為預測眼藥水的藥效、安全性和毒性對人體的影響的新方法備受期待，這些利用以往的動物實驗是難以實現的。

另外，作為動物實驗的代替方案也值得期待，有助于減少實驗動物的使用。近年來，從動物保護和倫理的角度出發(fā)，全球都在減少實驗動物的使用，有時甚至會禁止使用。例如，EU已經禁止在化妝品開發(fā)中使用實驗動物。像此次的研究這樣，迫切需要開發(fā)不使用實驗動物，而是實現人體模型的技術。

論文信息
題目：Multi-corneal barriers-on-a-chip to recapitulate eye blinking shear stress forces
期刊：《Lab on a Chip》
DOI：10.1039/C9LC01256G

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