新興單細胞診斷技術(shù)依賴于從復(fù)雜的生物基質(zhì)中快速有效地分離細菌的潛力。在表在《微系統(tǒng)與納米工程》上的一項研究中，美國機械工程、化學(xué)生物分子工程和生物工程跨學(xué)科部門的Jung Y. Han和同事開發(fā)了一種利用微流體多孔二氧化硅單體從全血液中分離出完整活菌的裝置。實現(xiàn)了機械溶血，同時提供完整和活的細菌通過單體大小為基礎(chǔ)的細菌分離和選擇性裂解通道。

研究探索了整體形態(tài)、幾何形狀和流動條件對細胞裂解的影響，以及允許多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌選擇性細胞裂解和選擇性通過的流動狀態(tài)。采用的技術(shù)結(jié)合單細胞拉曼光譜可以快速制備樣品并進行細菌分析。該研究提供了獨特的樣品制備步驟，以支持快速和無培養(yǎng)的細菌分析，在醫(yī)療點生物醫(yī)學(xué)設(shè)備的應(yīng)用。血液中的細菌可導(dǎo)致敗血癥、組織感染等嚴(yán)重狀況，需要及早發(fā)現(xiàn)血源性細菌才能有效治療。

利用定點診斷快速識別細菌的能力，可以極大地提高早期感染最佳治療的臨床潛力?，F(xiàn)有黃金標(biāo)準(zhǔn)細菌特征是基于表型細胞培養(yǎng)分析和需要至少24小時收集樣本、分析在診斷、臨床微生物學(xué)實驗室?，F(xiàn)有技術(shù)是穩(wěn)定和便宜的，但不能生成及時指導(dǎo)治療的初始階段結(jié)果。在本研究中，探索了微流控裝置與多孔二氧化硅單體作為簡單的通流元件，用于選擇性血細胞分析和細菌的完整分離，單體是由具有流體扭曲路徑開放細胞形態(tài)組成的多孔材料。

科學(xué)家可以在細胞灌注過程中通過高機械表面應(yīng)力來控制整體孔的形態(tài)，從而實現(xiàn)細胞的機械溶血，同時允許完整、活的細菌通過彎曲流動路徑進行無培養(yǎng)分離。研究對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌采用全血流動條件下細菌選擇性傳代的方法，盡管菌株不同。高通量選擇性單核細胞裂解技術(shù)與拉曼光譜等強大的分析方法相結(jié)合，可以在單個細胞水平上對全血中的細菌進行無培養(yǎng)分析。研究對之前的二氧化硅單體合成工藝進行了改進，然后水解和縮合二氧化硅，在低溫下形成二氧化硅玻璃。

為了制備二氧化硅單體，科學(xué)家們使用了由烷基硅酸鹽、聚乙二醇(PEG)作為致孔劑、尿素作為羥基離子來源的前驅(qū)體溶液，以盡量減少異質(zhì)性和乙酸。當(dāng)優(yōu)化合成工藝時，得到的單體是均勻的，并且很好地固定在硅毛細管壁上。科學(xué)家們測量了最終骨骼整體結(jié)構(gòu)的厚度，并用高效液相色譜法計算了其滲透性，以控制實驗條件。為了最大限度地減小內(nèi)部變化，將產(chǎn)生的毛細管切割成5厘米長的段，在使用前測試滲透率。

然后研究人員開發(fā)了兩種互補的低通量和高通量操作方法，將二氧化硅單體集成到微流體系統(tǒng)中。為了實現(xiàn)低通量操作，科學(xué)家們在熱塑性微流體芯片中嵌入了含有單體的毛細管段，以在集成過程中保護單體。對于高通量選擇性裂解，使用了微流體裝置中具有較大橫截面積的單體。完整的制作方法為全血灌注過程中無泄漏操作提供了良好可靠性。研究人員選擇陰溝腸桿菌(革蘭氏陰性，桿狀菌)和3種革蘭氏陽性菌作為原理驗證，探討其傳輸率；乳酸乳球菌、黃體微球菌和枯草芽孢桿菌。

在實驗過程中，用不同幾何形狀和流動條件的微流體單體灌注細菌溶液，利用動態(tài)光散射(DLS)檢測細菌的通過和血細胞的裂解。例如，純化后的陰溝腸桿菌經(jīng)單塊體灌注后，DLS峰沒有明顯變化，表明細菌的通道完整?？茖W(xué)家們證明了多孔整體器的長度對紅細胞裂解效率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)單核細胞長度大于1mm時，紅細胞裂解效率顯著提高。也研究了白細胞(WBCs)在單核細胞裝置運行過程中的命運，細胞在不被類似RBCs的裂解的情況下無法通過單核細胞。

從技術(shù)上講，紅細胞變形為盤狀，通過單核細胞，導(dǎo)致膜張力顯著增加，導(dǎo)致紅細胞裂解。相比之下，細菌細胞的尺寸與單粒石孔隙相似，因此成功通過而不破裂需要更少的細胞壁膨脹。科學(xué)家們優(yōu)化了設(shè)備參數(shù)，使不同細菌能夠承受高水平的膜應(yīng)力而不破裂。進一步的發(fā)展確保了細菌的完整傳代而不降解，并具有生存能力。為了獲得高通量細菌通道，科學(xué)家們稀釋了毛細管裝置中的血液。然而，作為另一種選擇，它們也可以擴大整體血液溶解的能力。

該裝置處理超過400μL摻入細菌的全血，然后由于細胞裂解導(dǎo)致的堵塞以及由于多孔基質(zhì)內(nèi)捕獲的完整白細胞（WBC）而顯示出背壓的顯著增加。為了定位目標(biāo)細菌，將一個沉積在玻璃載玻片上的樣品，該樣品經(jīng)過了整塊處理。通過手工掃描光學(xué)探針對樣品進行單細胞拉曼分析。研究人員希望在未來利用選擇性裂解技術(shù)，結(jié)合共焦拉曼顯微鏡來改進在確定的感興趣的位置，以低濃度檢測感興趣菌株的過程。共焦拉曼顯微鏡工具與新興的小型化手持系統(tǒng)結(jié)合起來，為快速便攜的護理點設(shè)備鋪平道路。

Copyright Science X Network/Thamarasee Jeewandara/Phys參考期刊《Nature Medicine》《PLoS ONE》《Microsystems & Nanoengineering》DOI: 10.1038/nm.3640DOI: 10.1371/journal.pone.0116837DOI: 10.1038/s41378-019-0063-4