對單個細胞的分離最基本要求就是：保證捕獲的質(zhì)量。如果用三個詞語概況就是：fast、effective、gentle

傳統(tǒng)的分離方法是：顯微操作（micromanipulation）、激光顯微切割（laser capture microdissection）、熒光激活細胞分選儀（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）。過去的十年許多高效的新方法開發(fā)出來，它們不僅僅是作為傳統(tǒng)方法的備選，更有望取代傳統(tǒng)方法。

新方法基于微流控芯片、液滴、微孔板，并且利用毛細管、磁吸、電場等實現(xiàn)了細胞自動化收集。

單細胞技術(shù)可以幫助檢測細胞異質(zhì)性、展示細胞對不同理化性質(zhì)的復(fù)雜反應(yīng)。另外還能鑒定罕見細胞群體，如：循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells， CTCs，它是存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統(tǒng)稱）、與治療或疾病相關(guān)的殘留細胞、干細胞等。生命系統(tǒng)的復(fù)雜性要求我們要在各個層次進行基因調(diào)控研究，包括DNA、mRNA的轉(zhuǎn)錄、不同的調(diào)控RNA（例如microRNA和一些non-coding RNA）、蛋白、細胞代謝、激素水平等，而且每個水平都有各自的分析手段，于是后來產(chǎn)生了針對單個細胞的多層面分析手段，最常用的就是針對核苷酸的qPCR、RNA/DNA-Seq，針對蛋白的免疫組化（immunohistochemistry，IHC）、定量質(zhì)譜（quantitative mass spectroscopy, MS），其中RNA-seq就是目前曝光率最高的，因為它增加通量的同時降低了費用。

要做這些分析，首先關(guān)心的就是如何在保證最少干擾細胞原始表達量的同時，將細胞收集起來。這些年發(fā)展起來的方法、儀器都有各自的優(yōu)缺點（考慮到時間、通量、價格、空間分辨率等），還有持續(xù)開發(fā)的（如：Stilla Technologies公司的ddPCR技術(shù)--digital droplet PCR-based）。

1.分離細胞的初衷—在混雜群體中找到自己想要的

選擇特定類型的細胞經(jīng)常是根據(jù)熒光標記，它包括兩種方式：一種是直接使用熒光抗體；另一種是用轉(zhuǎn)熒光基因的蛋白，會發(fā)出紅、黃、綠顏色，而且只在目標細胞群體中表達。

第一種利用抗體的方法缺點就在于：抗體數(shù)量有限（尤其是對研究不多的物種）、在不同細胞群體中可能有交叉反應(yīng)、背景標記模糊；

第二種方法雖然解決了第一種方法的一些問題，但是找這個合適的特異的marker基因比較困難，尤其是在一些病理條件下，細胞表達量驟增，可能這個marker也會在其他細胞類型中檢測到。

這兩種都不合適就要利用最粗暴的觀察手段，依據(jù)大小、形狀、在組織中的位置等特征。

2.收集細胞的傳統(tǒng)手段

主要有三種：顯微操作、熒光激活細胞分選（FACS）、激光纖維切割捕獲（LCM），這三種方式都有成熟、標準化的流程。前兩種可以在體外或脫離組織條件下分離細胞，LCM需要將細胞或組織固定（因此大多會導(dǎo)致細胞死亡，不過現(xiàn)在也有利用LCM分析活細胞的例子）。另外這三種方法的通量也是不同的，FACS分選細胞非常高效，短時間內(nèi)就能分選上千細胞；顯微操作和LCM方法就非常慢，通量也低。

因為前兩種方法需要組織裂解，所以基因的表達可能會受到影響，影響因素也有很多，例如：裂解方法、組織類型、試劑濃度、孵育時間、溫度等等，LCM方法因為是直接將RNA固定住，因此它會受這些外部因素影響小一些。不過LCM使用的固定試劑（例如福爾馬林）會使RNA產(chǎn)生降解，雖然現(xiàn)在有了不含福爾馬林的固定劑，但RNA的質(zhì)量還是會受到影響。

LCM方法最大的一個優(yōu)勢就是它能記錄空間信息，其他兩種因為做了組織裂解，所以得到的細胞不知道原來在組織的什么位置；另外一個優(yōu)點就是殘余的組織可以保存留用。不過這個方法需要技術(shù)的輔助，既然是切割，那么就存在混進不相關(guān)細胞的可能。細胞污染這個問題在顯微操作中也會存在，不過它混進來的可能是一點溶劑。既然可能存在“混雜”的問題，那么設(shè)置陰性對照就顯得很有必要。

這三種方法的具體對比如下圖：

分離得到細胞后，一般會收集到裂解緩沖液中，準備后續(xù)的scRNA的寡核苷酸barcode結(jié)合或質(zhì)譜技術(shù)的鑭系元素barcode結(jié)合。目前的趨勢是將細胞收集和后續(xù)反應(yīng)整合在一個設(shè)備中（就像10X的設(shè)備），實現(xiàn)end-to-end solution。

3.收集細胞的現(xiàn)代手段

高通量儀器

大多數(shù)儀器都配置了微流控的“l(fā)ab-on-chip”技術(shù)，能產(chǎn)生數(shù)百萬的定制的液滴，其中會包含單個細胞、寡核苷酸（例如用：anchored oligo-dT，目的是捕獲mRNA）、反轉(zhuǎn)錄試劑（產(chǎn)生cDNA），然后整個文庫制備一般會在gel beads中進行（例如10X）；另外液滴也可以單純作為捕獲容器，后續(xù)的反應(yīng)及文庫制備會在magnetic beads中進行（例如BD）。這種建庫測序的技術(shù)發(fā)展出了：Drop-seq、inDrop-Seq、SCRB-Seq或者公司自己設(shè)計的方案。以上的幾種方法都是基于poly-A富集mRNA的，因此它們屬于3'端建庫。

為了將建庫測序得到的reads成功回溯到某個細胞，就要在寡核苷酸上“做手腳”。每個細胞分配了一段特定的序列，叫做barcode。來自一個細胞的reads都共享同樣的barcode。另外還有一種情況，就是Illumina短序列測序需要擴增，擴增后才能根據(jù)cluster（也就是簇，一簇的reads都相同）來增加測序的準確性。當(dāng)然也就是在PCR這一步，可能會引入偏差（來源：不同的擴增模板的擴增效率不同，從而影響原始的數(shù)量比例）。對單細胞來講，它和bulk 轉(zhuǎn)錄組不同，本來reads數(shù)量就不多，如果再加上PCR bias的影響，噪音就太大了。于是引入了UMI（unique molecular identifiers，這個molecular就是指cDNA），每個初始cDNA分配一個獨特的UMI。如果擴增完發(fā)現(xiàn)，有兩個reads都屬于同一個cDNA molecule，它們的UMI就是一樣的，最后定量只會被計數(shù)一次

個人思考：PCR也不是十全十美，復(fù)制的結(jié)果就百分百和初始一樣，也會有錯誤率。同一批cDNA擴增的結(jié)果也有可能差幾個堿基，那么來自同一個cDNA的兩條reads的UMI可能就不一樣，差一兩個堿基是可能的，因此后續(xù)計算的時候，可能會設(shè)置一個容錯值（可能需要結(jié)合UMItools說明書看一下），就是說如果來自同一個cDNA的兩條reads結(jié)果UMI之差1個堿基其余都一樣，那么可能也會判斷它們是來自同一個cDNA的。

盡管基于液滴的技術(shù)很先進，但是也有局限。最主要的缺點就是RNA捕獲效率低，反轉(zhuǎn)錄施展不開（因為反轉(zhuǎn)錄過程只是發(fā)生在非常小的液滴空間中）、液滴很脆弱（泄露有風(fēng)險），另外當(dāng)起始細胞數(shù)量有限時，細胞捕獲效率低。但同時如果起始細胞數(shù)量太多，又容易導(dǎo)致douplets現(xiàn)象（一個液滴中包含兩個細胞），而且容易堵塞微流控芯片。因此，其他廠商探索了一些方法，利用細胞板（其中包含了成千上萬個微孔）捕獲大量細胞，并且每個微孔中也是放入了一個連接寡核苷酸的bead。之后的下游操作和基于液滴的方法就相似了。

結(jié)論

細胞富集技術(shù)（如FACS）和高通量單細胞儀器整合起來是一個趨勢，這樣可以避免測一大批細胞，最后僅僅用了一小部分，造成各方面的浪費。這樣整合起來可以有的放矢，我們可以僅僅選擇感興趣的細胞，然后高通量測序

一大挑戰(zhàn)就是細胞質(zhì)量的控制，目前沒有評估單個細胞質(zhì)量的工具。當(dāng)然是可以根據(jù)bulk 轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的表達量來定一個閾值，對每個細胞進行鑒定，比如看每個細胞中最少表達的基因數(shù)量。但不論怎樣，這些方法都是后續(xù)的檢驗，我們的樣本已經(jīng)被處理完了，最優(yōu)解還是測序之前就保證細胞的質(zhì)量

多個組學(xué)聯(lián)合分析是前景（ DNA, mRNA, regulatory RNA, proteins, metabolites），像10X就抓住了這個機會，好像BD也推出了Rhapsody蛋白檢測的功能

最后就是針對分析工具整合的期待，還沒有一個公認的分析流程出來，只有推廣度高低之分，比如Seurat、Scater、Monocle這幾個R包就推得比較多，那么說不定未來的標準流程就是它們。

文章來自：2018 Platforms for Single-Cell Collection and Analysis

文章來源：生信星球（公眾號），作者：豆豆花花。 內(nèi)容有刪減 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除。