所有的活組織都是由細(xì)胞組成的。為了研究細(xì)胞，科學(xué)家們將它們從原始組織中分離出來，并在受控和人造的環(huán)境中培育它們：這就是所謂的細(xì)胞培養(yǎng)。它于1907年首次使用，并在生物醫(yī)學(xué)實驗室中無處不在。細(xì)胞研究已經(jīng)從在2D表面上進(jìn)行演變?yōu)?/span>3D配置，以更接近地模擬人體內(nèi)自然的3D棲息地：這就是我們所說的3D細(xì)胞培養(yǎng)。

圖1  細(xì)胞療法或再生醫(yī)學(xué)

1.三維細(xì)胞培養(yǎng)的目的

細(xì)胞療法或再生醫(yī)學(xué)，它包括生長在患者體內(nèi)的細(xì)胞以修復(fù)受損組織。該領(lǐng)域包括幾個研究領(lǐng)域，如圖1所示。

用于藥物發(fā)現(xiàn)的3D 體外模型，其目的在于創(chuàng)建模擬活組織的3D細(xì)胞模型，以使大部分研究和藥物發(fā)現(xiàn)可以在體外而不是在動物（或人類）上完成。如圖2所示，3D體外模型旨在用于臨床試驗之前藥物發(fā)現(xiàn)的不同階段。

需要指出的是，細(xì)胞培養(yǎng)的另一個基本目標(biāo)通常是使用細(xì)胞產(chǎn)生病毒或抗體。然而，傳統(tǒng)上這是通過二維細(xì)胞培養(yǎng)實現(xiàn)的，除了提高產(chǎn)量外，沒有什么需要向真正的三維細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)變。

圖2 用于藥物發(fā)現(xiàn)的3D 體外模型

Allied Market的研究估計，截至2015年，全球3D細(xì)胞市場為7.65億美元，預(yù)計2022年將增長30％至469.9億美元 [4]。他們將市場分為四類：藥物發(fā)現(xiàn)，癌癥研究，再生醫(yī)學(xué)和干細(xì)胞研究。根據(jù)我們更廣泛的分類，我們認(rèn)為干細(xì)胞研究的一部分與再生醫(yī)學(xué)一起參與細(xì)胞治療。這是因為干細(xì)胞可以在體外分化成所需的細(xì)胞類型并被重新植入以修復(fù)組織。另一方面，我們認(rèn)為，雖然癌癥和干細(xì)胞研究是他們自己的主要參與者，但他們在開發(fā)3D體外模型方面發(fā)揮了重要作用。因此，我們發(fā)現(xiàn)大部分市場有助于藥物發(fā)現(xiàn)的3D體外建模（圖3）。這在很大程度上是由于癌癥研究的一個重大推動，而癌癥研究本身就是世界范圍內(nèi)癌癥發(fā)病率上升。

2.三維細(xì)胞培養(yǎng)的種類

微芯片、生物反應(yīng)器、水凝膠等。

3.誰對3D細(xì)胞培養(yǎng)感興趣？

從地理位置上看，Allied Market Research估計2015年美國是三維細(xì)胞市場中最大的演員，占市場的41％，而歐洲占29％，亞太占19％，巴西，南非和沙特阿拉伯占11％（圖5）。2022年，他們估計美國和歐洲在市場上的重要性之間的差距將會減小，美國的貢獻(xiàn)率為35.3％，其次是歐洲的31.5％。

  三種主要類型的終端用戶參與3D細(xì)胞培養(yǎng)市場：生物技術(shù)和制藥公司，學(xué)術(shù)實驗室和合作研究實驗室。

4.為什么要多加一個第三維？

答案很簡單：因為在正常的環(huán)境中，細(xì)胞在三維空間中演化！現(xiàn)在確定細(xì)胞在3D中的表現(xiàn)與2D相比有很大不同。當(dāng)3D中的細(xì)胞顯示出與2D中的細(xì)胞不同的反應(yīng)時，這證明3D培養(yǎng)細(xì)胞用于藥物測試至關(guān)重要。

簡而言之，在3D中培養(yǎng)細(xì)胞允許細(xì)胞采用類似于體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的形態(tài)學(xué)和遷移模式。重新形成細(xì)胞的正常形態(tài)是重要的，因為它們的形狀可以直接影響它們的生物活性[8]。由于細(xì)胞遷移是許多疾?。ㄈ绨┌Y）中的一個中心過程，可以以藥理學(xué)為靶點，因此在體外忠實地復(fù)制遷移模式也很重要。一般來說，將細(xì)胞放置在3D中有效地增加了它們與其周圍環(huán)境的相互作用程度。它迫使它們在整個表面區(qū)域與它們的微環(huán)境（無論是支架，水凝膠還是其他細(xì)胞）進(jìn)行更大程度的相互作用，就像它們在組織中所做的那樣。這是至關(guān)重要的，因為現(xiàn)在已知細(xì)胞與其ECM和微環(huán)境的相互作用對許多細(xì)胞功能是必不可少的[7-9]。另外，3D支持系統(tǒng)提供物理和生物化學(xué)錨定，可以被設(shè)計為在體內(nèi)復(fù)制條件。構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的剛度，孔徑或配體可以被微調(diào)以模擬感興趣的組織。最后，3D細(xì)胞培養(yǎng)允許形成和研究更復(fù)雜的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，例如球體，類器官或微血管。

5.用于藥物發(fā)現(xiàn)的3D體外模型

問題：藥物發(fā)現(xiàn)過程中真正的瓶頸

發(fā)現(xiàn)了一種在實驗室中成功治療疾病的藥物！這是一個里程碑。這通常意味著你已經(jīng)在小鼠身上研究了藥物?，F(xiàn)在，您需要決定是否要花費大量的時間和金錢來通過嚴(yán)格的法規(guī)和更多的臨床前測試，直到您的藥物可以在人體臨床試驗中進(jìn)行測試。只有發(fā)現(xiàn)......什么也不做，更糟的是，無法預(yù)料的副作用。

這是目前藥物發(fā)現(xiàn)過程的悲傷現(xiàn)實：在小鼠中使用的10種藥物中約有9種不在人體中 （圖7）。這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，問題很可能在于臨床前模型的預(yù)測能力：我們需要更好地重述人類對藥物反應(yīng)的模型。特別是認(rèn)為主要問題在于未能預(yù)測藥物的療效及其毒性。這是目前制藥行業(yè)面臨的巨大瓶頸。想象一下平均10年的花費和26億美元的無花果。仍然想知道為什么我們目前還沒有輕易治愈所有重大疾??？

我們需要重新考慮藥物發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)，以便更有選擇性地過濾最終對人類起作用的藥物。其目的提高藥物發(fā)現(xiàn)過程的成功率，提高產(chǎn)量并降低相關(guān)成本。

不用說，新的試劑不能直接在人體上測試，事先沒有證據(jù)證明其潛在的毒性。相反，科學(xué)家傳統(tǒng)上一直使用替代模型來預(yù)測藥物在人類中的作用，例如動物或細(xì)胞模型，各有利弊（圖8）。請注意，圖8中列出的大多數(shù)優(yōu)點和缺點適用于整個體外模型，即2D和3D蜂窩系統(tǒng)。

利用動物模型的主要優(yōu)勢是無與倫比的。這意味著不僅可以評估藥物對細(xì)胞的局部影響（就像您在典型的簡單細(xì)胞研究中那樣），還可以評估其對整個身體（換句話說，對于多個器官）的系統(tǒng)影響。同樣，現(xiàn)在越來越明顯，細(xì)胞的微環(huán)境不僅影響細(xì)胞的生理機(jī)制，而且影響它們對藥物的反應(yīng)[42]：因此，能夠研究藥物在動物中的作用是有利的，細(xì)胞類型正在實時交互。

雖然眾多強(qiáng)大的老鼠模型已經(jīng)被描述，但它們的一些內(nèi)在限制將難以克服。例如，動物的結(jié)果固有地基于非人類細(xì)胞和病原體，其可能不能完全地模擬人類藥理學(xué)反應(yīng)。雖然研究已將人類細(xì)胞引入小鼠，但通常必須在免疫系統(tǒng)受損的小鼠中進(jìn)行以防止人類細(xì)胞排斥。這反過來意味著動物模型不能正確反映免疫細(xì)胞的作用，應(yīng)該考慮到這一點，因為很明顯免疫細(xì)胞是許多疾病的關(guān)鍵演員。在任何情況下，小鼠中引入的人類細(xì)胞都與鼠源的細(xì)胞微環(huán)境相互作用，這可能不能正確反映患者中發(fā)生的全人體細(xì)胞相互作用。相反，細(xì)胞研究可以完全由人類細(xì)胞組成。這避免了將動物結(jié)果外推到人體所造成的差異，這對免疫系統(tǒng)來說尤其明顯。盡管細(xì)胞模型仍未能總是預(yù)測人類對藥物的正確反應(yīng)，但三維細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域仍處于起步階段，并且正在迅速發(fā)展; 因此可能比動物模型更適合填補(bǔ)臨床前預(yù)測模型中的當(dāng)前缺口。事實上，許多新興的3D細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品已經(jīng)在藥物發(fā)現(xiàn)過程中實施。傳統(tǒng)上，三維器官芯片已廣泛用于學(xué)術(shù)環(huán)境中的疾病建模。他們現(xiàn)在也正在轉(zhuǎn)向更多的藥理學(xué)應(yīng)用，如藥物篩選，毒性和藥代動力學(xué)檢測。3D細(xì)胞培養(yǎng)也可以大大推進(jìn)細(xì)胞治療領(lǐng)域。

6.細(xì)胞療法

細(xì)胞療法的目標(biāo)是替換患者損傷或衰竭器官的組織。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，在進(jìn)行基礎(chǔ)體外研究和開發(fā)用于使細(xì)胞最終植入患者體內(nèi)的方案方面作出了巨大努力，使用各種3D細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品。

支架裝載細(xì)胞并最終植入患者體內(nèi)以局部再生目標(biāo)組織。

三維支架可放置在生物反應(yīng)器內(nèi)以促進(jìn)三維細(xì)胞的研究，優(yōu)化組織生長并預(yù)測植入物在植入后的機(jī)械響應(yīng)。這在生物反應(yīng)器中得到了獨特的促進(jìn)，因為它們能夠?qū)ε囵B(yǎng)環(huán)境提供如此嚴(yán)格的控制，并且能夠?qū)M織進(jìn)行物理調(diào)節(jié)，以模擬細(xì)胞在移植后會發(fā)生的作用力[2]。傳感器通常集成在生物反應(yīng)器中，這有助于建立計算模型并獲得精確的實驗數(shù)據(jù)，以預(yù)測細(xì)胞對其植入體內(nèi)的反應(yīng)。

可以向患者注射   干細(xì)胞以促進(jìn)組織特異性再生。有趣的是，已經(jīng)表明與3D中的培養(yǎng)相比，3D中的生長干細(xì)胞具有臨床益處。例如，在3D中擴(kuò)展球體中的間充質(zhì)干細(xì)胞增強(qiáng)了它們在小鼠移植后的抗炎反應(yīng)[15]。干細(xì)胞的球體也被用于提高臨床試驗中干細(xì)胞生產(chǎn)的產(chǎn)量。

類固醇是由干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞體外發(fā)育而來的，它們自我組織成類似于器官的基本顯微解剖結(jié)構(gòu)[16]。因此，人們認(rèn)為他們有朝一日可以成為替代某些器官的移植來源。到今天為止，復(fù)制腎臟或冒號的類器官已經(jīng)移植到小鼠身上，并且長期植入成功。

可以使用3D打印器官進(jìn)行移植，而不是使用自組裝的類器官。雖然我們遠(yuǎn)不能印刷整個器官的精確復(fù)制品，但已經(jīng)成功地植入動物和人體中的膀胱，氣管，骨和軟骨的生物印刷品[17]。

最后，雖然微流體芯片往往與建立3D體外模型更相關(guān)，但是一些微流體工具已經(jīng)被開發(fā)用于將細(xì)胞包封在3D ECM中，其可以植入患者體內(nèi)。一項研究使用微流體裝置來制造水凝膠微纖維，然后將其用于在小鼠中包封和植入胰島。

7.微流控

微流控技術(shù)依賴于使用10-100微米高度或?qū)挾鹊男⊥ǖ纴硖幚硇◇w積流體。它們與傳統(tǒng)的3D細(xì)胞模型的關(guān)鍵特點是它們能夠更好地控制細(xì)胞，物理和生物化學(xué)微環(huán)境。這使得研究人員能夠模仿更全面的人體組織的復(fù)雜細(xì)胞模型[23]。

微流控芯片的設(shè)計可以由許多不同的通道或隔室組成，可以很容易地滿足研究人員的需求。這種區(qū)室化允許在生理長度尺度上對細(xì)胞分布進(jìn)行獨特的空間控制，特別是對于不同細(xì)胞類型的共培養(yǎng)?，F(xiàn)在許多微芯片已經(jīng)將電子和機(jī)械致動器（例如閥門或開關(guān)）集成到微芯片上，從而有助于在同一芯片上實現(xiàn)多個連續(xù)步驟。這個概念通常被稱為芯片實驗室（lab-on-a-chip）：許多耗時的實驗室任務(wù)可以微型化并自動化集成到微流控芯片上。與傳統(tǒng)的宏觀測定相比，這種小型化還減少了所需的試劑和細(xì)胞的消耗，這降低了成本。

通道的存在允許在尺度上控制流量。這有助于跨越通道形成化學(xué)或物理梯度（例如細(xì)胞因子梯度或間質(zhì)壓力），這在許多生物過程中是重要的。

微流控芯片中的細(xì)胞與顯微鏡物鏡之間的短距離能夠以比其他傳統(tǒng)宏觀體外系統(tǒng)更高的分辨率成像整個樣品。

微芯片 存在一些重要的限制：主要的是如果需要進(jìn)行后續(xù)測試，則細(xì)胞難以檢索。另外，即使它們被檢索到，大小也可能不足以用于后續(xù)測試。然而這些挑戰(zhàn)正在逐漸在克服，以適應(yīng)3D細(xì)胞培養(yǎng)市場的需求。

8.顯微鏡下3D細(xì)胞培養(yǎng)的未來

為了跟上藥物發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞治療市場日益增長的需求，3D細(xì)胞培養(yǎng)面臨著許多挑戰(zhàn)。

第一個是可重復(fù)性：通常，3D細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果太可變。這種可變性的來源是三個方面。第一個是生物。眾所周知，細(xì)胞和細(xì)胞衍生的產(chǎn)物（如Matrigel或血清）在不同批次的生產(chǎn)中是不同的。第二個變異來源是基于用戶的：與3D細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的許多程序如移液是手動完成的，因此容易受到用戶依賴性的變化影響。最后，很多方案可能受環(huán)境因素的影響，這些環(huán)境因素在測定中通常不受局部控制，例如溫度或濕度，這些因素可能會非常影響關(guān)鍵步驟，如3D凝膠聚合。同時，3D細(xì)胞培養(yǎng)程序遠(yuǎn)非易事。他們需要專業(yè)和訓(xùn)練有素的工作人員長。另外，這些任務(wù)耗時且成本高昂。

這些問題都指向了3D細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的兩大需求：自動化和標(biāo)準(zhǔn)化。理想情況下，需要新產(chǎn)品來促進(jìn)這些三維細(xì)胞培養(yǎng)過程，并減少人為干預(yù)，以最大限度地減少人為錯誤，加快并提高吞吐量和再現(xiàn)性。目前，細(xì)胞傳代或細(xì)胞擴(kuò)增等任務(wù)的自動化正在進(jìn)行中[2]。

3D細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的另一個主要瓶頸是缺乏簡單的讀數(shù)。太多的研究都嚴(yán)重依賴3D成像來分析細(xì)胞形態(tài)，遷移或生存能力。這需要大量的時間，并需要使用昂貴的專用設(shè)備，如共聚焦顯微鏡。同時，還需要努力使分析方法標(biāo)準(zhǔn)化為了量化這些結(jié)果：重建3D圖像遠(yuǎn)非易事。雖然有幾種3D重建軟件包可以在商業(yè)上獲得，但仍然很難定義，提取和量化來自這些復(fù)雜數(shù)據(jù)集的新變量。

微流控技術(shù)已經(jīng)顯示出自動化和簡化繁瑣程序的巨大潛力。例如，一些微流控芯片具有自動化的ELISA方法[28]，并且將質(zhì)譜結(jié)合到微流控芯片上。這最大限度地降低了成本和時間，但也有助于通過最大限度地減少人為干預(yù)來標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果 然而，朝著3D中細(xì)胞的操縱方向發(fā)展可能會更困難。雖然在微流控工具中操作流體是常規(guī)操作，但操作和混合不同粘度的溶液（如細(xì)胞懸浮液和3D水凝膠）更具挑戰(zhàn)性，因為它需要克服層流。

團(tuán)隊還發(fā)現(xiàn)了將微流體芯片與簡單讀數(shù)相結(jié)合的方法。例如，Whitesides小組開發(fā)了比色紙基微流控技術(shù)，這樣檢測結(jié)果只是通過顏色變化顯示[29]。微流體芯片還具有促進(jìn)個性化醫(yī)療的明顯優(yōu)勢。

與此同時，努力開發(fā)具有受控環(huán)境的微流控芯片，就像生物反應(yīng)器一樣。例如，重新創(chuàng)建缺氧環(huán)境的微流體工具已經(jīng)被創(chuàng)造出來以模擬癌組織中的缺氧[30]。在另一項研究中，將微流控芯片連接到壓力控制器上，以便在細(xì)胞上施加周期性的壓力和變化，就像在肺部經(jīng)歷的那樣[31]。換句話說，微流控芯片可以成為他們自己的微生物反應(yīng)器，從而獲得生物反應(yīng)器為3D細(xì)胞培養(yǎng)提供的許多益處。同時，集成傳感器的微流體正在開發(fā)中[32]，并且很可能在不久的將來變得更加普及。傳感器的存在與生物反應(yīng)器非常相似，可以監(jiān)測重要變量并有助于實現(xiàn)自動化和可追溯性。

微流體技術(shù)實現(xiàn)的自動化，小型化和高精度也將有助于標(biāo)準(zhǔn)化的程序，如細(xì)胞分化。事實上，需要分化的細(xì)胞如干細(xì)胞或單核細(xì)胞通常使用常規(guī)的宏觀體外方案進(jìn)行分化，如果不控制化學(xué)和環(huán)境刺激，則可能容易產(chǎn)生大的變異。相反，微流控芯片可以精確控制培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，或氧濃度或流體特性，所有這些都可以影響干細(xì)胞的分化[33]。與此同時，這些芯片與蛋白質(zhì)分析等傳感器的結(jié)合使得細(xì)胞分化過程中特定線索和信號通路的作用得以解開[34]。

由微流體促成的小型化和自動化提供了從科學(xué)中心向更其他方面的繁瑣程序的最終可能性。這已經(jīng)用于測試肝功能的微流體[35]。相反，3D細(xì)胞培養(yǎng)的微流體應(yīng)用目前需要許多步驟，只能在實驗室進(jìn)行。然而，隨著研發(fā)進(jìn)展，3D細(xì)胞培養(yǎng)微流體技術(shù)也可能成為即時診斷方法，如果在偏遠(yuǎn)地區(qū)，直接在診所中使用也不是不可能。

獨特的微流控芯片可以使血管結(jié)構(gòu)灌注。簡言之，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞在適當(dāng)?shù)?/span>3D凝膠（例如纖維蛋白）中混合時，它們形成血管。雖然這可以以任何形式發(fā)生，但微流控芯片中的容器形成直接連接到微流體通道的開口[36]，[37]。這意味著可以通過微流體通道直接進(jìn)入血管的血管內(nèi)隔室，使得血管可以被顆粒，細(xì)胞或培養(yǎng)基灌注。這對于重新創(chuàng)造許多涉及脈管系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞或分子運輸?shù)纳飳W(xué)過程或僅僅是為了能夠在脈管系統(tǒng)內(nèi)灌注藥物至關(guān)重要，因為它們將在患者中遞送。另一方面，類器官也可以在微流體芯片中生長以更好地控制其發(fā)展。那是，微流體隔室會限制并因此在一定程度上控制器官形狀和尺寸。最終，可以將類器官與微流體芯片內(nèi)的血管網(wǎng)絡(luò)混合以獲得可灌注的器官型模型，并實現(xiàn)更復(fù)雜的組織模型。最終，將干細(xì)胞/類固醇結(jié)合到微流控芯片中意味著能夠使用患者衍生細(xì)胞創(chuàng)建個性化的細(xì)胞模型[27]。

與此同時，微流控系統(tǒng)在免疫細(xì)胞研究中具有獨特的優(yōu)勢，正如其他地方廣泛審查的一樣[23]。這是因為它們允許建立細(xì)胞因子梯度，這對免疫細(xì)胞是重要的指導(dǎo)線索。微流體模型提供的流量控制對于在血液循環(huán)中重建免疫細(xì)胞運輸至關(guān)重要。沿著同樣的路線，先前討論的在微流控芯片上灌注血管的能力對于在血管內(nèi)和血管內(nèi)再生免疫細(xì)胞運輸也是獨一無二的，就像它們在體內(nèi)一樣。最后，免疫細(xì)胞是高度移動的和異質(zhì)細(xì)胞，必須經(jīng)常將其視覺化以作為研究它們的手段。微芯片極大地促進(jìn)了它們的高分辨率成像以進(jìn)行詳細(xì)分析。

最后，微芯片一直是器官芯片的唯一技術(shù)努力[25]。正如我們之前所討論的，由微芯片提供的對微環(huán)境的增強(qiáng)控制使得該技術(shù)對于開發(fā)器官型模型而言是獨特的。另外，促進(jìn)流動使得器官之間的連接和相互作用能夠使分子從一個器官轉(zhuǎn)移到另一個器官。這些相互作用已被證明是藥物測試的關(guān)鍵。例如，腸道和肝臟已經(jīng)在芯片上結(jié)合，因為藥物首先通過腸道吸收，然后通過肝臟代謝[38]。他們的組合已被證明影響藥物的命運不同于膽汁肝臟分別培養(yǎng)的芯片[39]。在胃內(nèi)加入胃還可能對模擬胃排空很重要，所有這些都會影響藥物的藥代動力學(xué)[40]。

最近，研究人員首次在3D芯片上進(jìn)行了生物打印 -心臟芯片：這對促進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化芯片制造器件顯示出巨大的希望。此外，柔性傳感器被集成在組織的微架構(gòu)中。

總而言之，我們相信微流體技術(shù)為3D細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域提供了很多可能，如果努力將其潛力從學(xué)術(shù)環(huán)境轉(zhuǎn)化為臨床方面。然而，所有這些都需要工程師，生物學(xué)家，臨床醫(yī)師，健康監(jiān)管人員之間的合作和努力......